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PHOTOACTIVATABLE TET EXPRESSION CONTROL SYSTEM

Foreign code F200010259
File No. K108P26WO
Posted date Nov 9, 2020
Country WIPO
International application number 2019JP034217
International publication number WO2020045651
Date of international filing Aug 30, 2019
Date of international publication Mar 5, 2020
Priority data
  • P2018-163617 (Aug 31, 2018) JP
Title PHOTOACTIVATABLE TET EXPRESSION CONTROL SYSTEM
Abstract The present invention provides a photoactivatable Tet-Off/On system enabling accurate temporal and spatial control of gene expression. The present invention is a PA-Tet-Off/On system comprising: a target gene expression cassette provided with a TRE that contains a TetO sequence, a promoter that is controlled by the TRE, and a target gene wherein the expression of said gene is controlled by the promoter; a first fusion protein expression cassette provided with a gene that codes for a first fusion protein containing TetR or rTetR and a first protein; and a second fusion protein expression cassette provided with a gene that codes for a second fusion protein containing p65AD and a second protein, wherein the first protein and the second protein bind together to form a heterodimer only when irradiated at a specific wavelength.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Tet-OFF/ON system, Tet operator sequence (TetO) Tet repressor (TRE) and Tet response factors (TetR) are used for the interaction, a more stable and Tet (Dox) doxycycline Tet analog by processing, in a target cell to modulate the expression of the exogenous gene (for example, see Non-Patent Document 1.). Tet-OFF system, in the absence of Dox, TetR fusion protein and the transcriptional activation domain is coupled to the TRE, downstream of the minimum gene expression promoter is activated. Tet-ON system, in the presence of a Dox, reverse transcriptional activation domain and TetR (rTetR) coupled to the TRE of the fusion protein, a minimum downstream gene expression promoter is activated. Tet-OFF/ON system, the most commonly used in mammalian cells chemically in a controlled system, a small molecule expression regulatory Dox for this reason, the expression of target genes, for a limited time frame and, only in cells within a limited space is difficult to perform. For example, an individual occurrence and maintenance of stem cells maintain tissue homeostasis, proliferation, cell differentiation in the case of the, stem or progenitor cell gene expression plays an important role in dynamic role has been known. In addition, these phenomena, the circadian rhythm or clock is about the function of the gene-rhythms is a close correlation is known. However, the Tet-OFF/ON system, these studies required adaptation of the temporal resolution, spatial resolution may be impossible to perform an operation, such as the rapid activation of a gene of interest or need to deactivate the research, is not suitable for the experiment.
In a conventional gene expression is controlled to overcome the technical limitations of the system, temporal, spatial control can be achieved as a system for gene expression, gene expression (ON/OFF) by light irradiation can be controlled, that is photoactivatable (photoactivatable,PA) expression system has been developed. By performing the control of gene expression with light, the light irradiation area as well as adjusting the radiation intensity, only the cells in a particular space, in a limited time frame, the expression of target genes can be easily derived. For example, in the light activated transcription factor PA-Gal4/UAS GAVPO (Light-ON system) using the system, basic helix loop, helix (bHLH) transfer of the functional importance of the dynamic changes in gene expression analysis has been reported (Non-Patent Document 2 and Non-Patent Document 3). GAVPO is activated and deactivated for a rapid reaction rate, by changing the light irradiation pattern, neural stem cell gene expression in various kinetics Ascl1 (for example, to continuously or vibration) can be directed to a man.
Proteins that interact with the light-dependent module, a blue-responsive from the Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) hetero-dimer formation and module. The module comprises a light receptor and its specific binding proteins, Cry2(Cryptochrome 2) is made CIB1(cryptochrome-interacting basic helix-loop-helix 1) (for example, Non-Patent Document 4-8). Arabidopsis thaliana Cry2 is, via regulation of the circadian rhythm to modulate growth and development of the plant the photolyase-like light receptor. Cry2 is, N photopolyase homology region (PHR) and the end of the terminal extension 2 of the (CCE or CCT) Cryptochrome C of the two domains. The PHR, flavin adenine dinucleotide (FAD) chromophore in the chromophore-binding domain of non-covalent. Cry2 is, specific bHLH transcription factor to the blue light CIB1 can be coupled. Cry2 and essential domain truncated is CIB1, the hetero-dimer formation on the blue light which acts as a module. In addition, some point mutations Cry2, faster or slower the light cycle was shown to induce (Non-Patent Document 9, Non-Patent Document 10, Non-Patent Document 11).
In addition, the near-infrared photoresponsive hetero-dimer formation as a module, and the photosynthesis bacteria rod pseudomonas, phytochrome BphP1 (Rhodopseudomonaspalustris) pulse is derived from tris-specific binding protein and a protein PpsR2 and modules (for example, Non-Patent Document 27). 740-780nm PpsR2 BphP1 and to the near-infrared light is irradiated, both may be bonded to form a heterodimer. The heterodimer, including eukaryotic and mammalian endogenous chromophore Biliverdin (BV) may be used to absorb the near-infrared light is formed. In addition, a large number of domain PpsR2 relatively large protein. Therefore, to improve the BphP1/PpsR2 system, N and C terminal side deleting the terminal side, and the Q-linker domain PAS1 only at the downstream of the mutant PpsR2 using a (Q-PAS1) BphP1/Q-PAS1 systems have been developed (for example, Non-Patent Document 28-29) has.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
 TetO配列を含むテトラサイクリン応答因子と、前記テトラサイクリン応答因子の下流に位置し、かつ前記テトラサイクリン応答因子に制御されるプロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し、かつ前記プロモーターに発現を制御される標的遺伝子と、を備える標的遺伝子発現カセットと、
 Tetリプレッサータンパク質又はリバースTetリプレッサータンパク質と、第1のタンパク質とを含む第1の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第1融合タンパク質発現カセットと、
 転写活性化因子p65の転写活性化ドメインと、第2のタンパク質とを含む第2の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第2融合タンパク質発現カセットと、
を備え、
 前記第1のタンパク質と前記第2のタンパク質が、特定の波長が照射された状態でのみ互いに結合してヘテロ二量体を形成する、光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。

[請求項2]
 前記Tetリプレッサータンパク質又はリバースTetリプレッサータンパク質が、大腸菌の野生型Tetリプレッサータンパク質の194番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がトレオニン残基である、請求項1に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。

[請求項3]
 前記第1の融合タンパク質において、Tetリプレッサータンパク質又はリバースTetリプレッサータンパク質と、前記第1のタンパク質とが、SPKKKで表されるアミノ酸配列からなるペプチドリンカーにより連結されている、請求項1又は2に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。

[請求項4]
 前記第1のタンパク質がCIB1又はその変異体であり、前記第2のタンパク質がCry2又はその変異体である、又は、
 前記第1のタンパク質がCry2又はその変異体であり、前記第2のタンパク質がCIB1又はその変異体である、請求項1~3のいずれか一項に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。

[請求項5]
 前記第1のタンパク質がCIB1又はその変異体であり、前記第2のタンパク質がCry2又はその変異体である、請求項4に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。

[請求項6]
 前記第1の融合タンパク質が、Tetリプレッサータンパク質又はリバースTetリプレッサータンパク質のC末端側にCIB1又はその変異体が連結されている、請求項5に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。

[請求項7]
 前記第1の融合タンパク質に含まれるCIB1又はその変異体が、シロイヌナズナの野生型CIB1の1~170番目のアミノ酸からなる領域に相当する部分タンパク質からなるCIB1のC末端欠損体、又は前記CIB1のC末端欠損体中の核局在シグナルが欠損した変異体である、請求項5又は6に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。

[請求項8]
 前記第1の融合タンパク質に含まれるCIB1又はその変異体が、シロイヌナズナの野生型CIB1の1~170番目のアミノ酸からなる領域に相当する部分タンパク質からなるCIB1のC末端欠損体の核局在シグナルが欠損した変異体であり、
 前記第2の融合タンパク質が、N末端又はC末端に核局在シグナルを含む、請求項7に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。

[請求項9]
 前記第2の融合タンパク質に含まれるCry2又はその変異体が、N末端フォトポリアーゼ相同性領域を含むC末端欠損体、又は前記C末端欠損体のうち、シロイヌナズナの野生型Cry2の348番目のロイシンに相当するアミノ酸残基がフェニルアラニンに置換された変異体である、請求項5~8のいずれか一項に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。

[請求項10]
 前記第1のタンパク質がBphp1又はその変異体であり、前記第2のタンパク質がQ-PAS1又はその変異体である、又は、
 前記第1のタンパク質がQ-PAS1又はその変異体であり、前記第2のタンパク質がBphp1又はその変異体である、請求項1~3のいずれか一項に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。

[請求項11]
 前記第1のタンパク質がBphp1又はその変異体であり、前記第2のタンパク質がQ-PAS1又はその変異体である、請求項10に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。

[請求項12]
 前記第2の融合タンパク質が、N末端に核局在シグナルを含み、かつ転写活性化因子p65の転写活性化ドメインのC末端側にQ-PAS1又はその変異体が連結されている、請求項11に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。

[請求項13]
 前記第1の融合タンパク質が、Tetリプレッサータンパク質又はリバースTetリプレッサータンパク質のN末端側に、Bphp1又はその変異体が連結されており、
 前記第2の融合タンパク質が、転写活性化因子p65の転写活性化ドメインのC末端側にQ-PAS1又はその変異体が連結されている、請求項11又は12に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。

[請求項14]
 前記標的遺伝子発現カセットと、
 前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質がT2A自己消化ペプチドで連結されたタンパク質の発現カセット、又は、前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質をバイシストロニック発現させる発現カセットと、
を備える、請求項1~13のいずれか一項に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。

[請求項15]
 前記標的遺伝子が、ユビキチン修飾されたタンパク質をコードする遺伝子である、請求項1~14のいずれか一項に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム。

[請求項16]
 請求項1~15のいずれか一項に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システムを含む細胞。

[請求項17]
 請求項16に記載の細胞に対して、青色光又は近赤外光の照射の有無、及びテトラサイクリン系化合物処理の有無を調整することにより、前記細胞における前記標的遺伝子の発現を制御する、標的遺伝子の発現制御方法。

[請求項18]
 TetO配列を含むテトラサイクリン応答因子と、前記テトラサイクリン応答因子の下流に位置し、かつ前記テトラサイクリン応答因子に制御されるプロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し、標的遺伝子を組み込むためのマルチクローニングサイトとを含む標的遺伝子発現用ベクターと、
 Tetリプレッサータンパク質又はリバースTetリプレッサータンパク質と、CIB1又はその変異体とが連結された第1の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第1融合タンパク質発現カセットを含む第1の発現ベクターと、
 転写活性化因子p65の転写活性化ドメインと、Cry2又はその変異体とが連結された第2の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第2融合タンパク質発現カセットを含む第2の発現ベクターと、
を含む、光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム用キット。

[請求項19]
 TetO配列を含むテトラサイクリン応答因子と、前記テトラサイクリン応答因子の下流に位置し、かつ前記テトラサイクリン応答因子に制御されるプロモーターと、前記プロモーターの下流に位置し、標的遺伝子を組み込むためのマルチクローニングサイトとを含む標的遺伝子発現用ベクターと、
 Tetリプレッサータンパク質又はリバースTetリプレッサータンパク質と、Bphp1又はその変異体とが連結された第1の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第1融合タンパク質発現カセットを含む第1の発現ベクターと、
 転写活性化因子p65の転写活性化ドメインと、Q-PAS1又はその変異体とが連結された第2の融合タンパク質をコードする遺伝子を備える第2融合タンパク質発現カセットを含む第2の発現ベクターと、
を含む、光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム用キット。

[請求項20]
 前記第1の発現ベクターと前記第2の発現ベクターに代えて、
 前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質がT2A自己消化ペプチドで連結されたタンパク質の発現カセット、又は、前記第1の融合タンパク質と前記第2の融合タンパク質をバイシストロニック発現させる発現カセットを含む発現ベクターを含む、請求項18又は19に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム用キット。

[請求項21]
 前記Tetリプレッサータンパク質又はリバースTetリプレッサータンパク質が、大腸菌の野生型Tetリプレッサータンパク質の194番目のイソロイシンに相当するアミノ酸残基がトレオニン残基である、請求項18~20のいずれか一項に記載の光活性化可能なテトラサイクリン遺伝子発現制御システム用キット。

[請求項22]
 Tetリプレッサータンパク質又はリバースTetリプレッサータンパク質と、CIB1又はその変異体とが連結された融合タンパク質を発現させるための発現カセットを含む、発現ベクター。

[請求項23]
 転写活性化因子p65の転写活性化ドメインと、Cry2又はその変異体とが連結された融合タンパク質を発現させるための発現カセットを含む、発現ベクター。

[請求項24]
 Tetリプレッサータンパク質又はリバースTetリプレッサータンパク質と、Bphp1又はその変異体とが連結された融合タンパク質を発現させるための発現カセットを含む、発現ベクター。

[請求項25]
 転写活性化因子p65の転写活性化ドメインと、Q-PAS1又はその変異体とが連結された融合タンパク質を発現させるための発現カセットを含む、発現ベクター。

[請求項26]
 Tetリプレッサータンパク質若しくはリバースTetリプレッサータンパク質とCIB1若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質と、転写活性化因子p65の転写活性化ドメインとCry2若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質とが、T2A自己消化ペプチドで連結されたタンパク質の発現カセット、又は、
 Tetリプレッサータンパク質若しくはリバースTetリプレッサータンパク質とCIB1若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質と、転写活性化因子p65の転写活性化ドメインとCry2若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質とを、バイシストロニック発現させる発現カセット
を含む、発現ベクター。

[請求項27]
 Tetリプレッサータンパク質若しくはリバースTetリプレッサータンパク質とBphp1若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質と、転写活性化因子p65の転写活性化ドメインとQ-PAS1若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質とが、T2A自己消化ペプチドで連結されたタンパク質の発現カセット、又は、
 Tetリプレッサータンパク質若しくはリバースTetリプレッサータンパク質とBphp1若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質と、転写活性化因子p65の転写活性化ドメインとQ-PAS1若しくはその変異体とが連結された融合タンパク質とを、バイシストロニック発現させる発現カセット
を含む、発現ベクター。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY
  • Inventor
  • IMAYOSHI Itaru
  • YAMADA Mayumi
  • SUZUKI Yusuke
  • NAGASAKI Shinji
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JO JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
Reference ( R and D project ) PRESTO Innovative technology platforms for integrated single cell analysis AREA
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