CAPSULE PROTEIN AND MULTIMERIC COMPLEX COMPOSITION THEREOF, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION USING SAME
| 外国特許コード | F210010291 |
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| 整理番号 | (S2019-0482-N0) |
| 掲載日 | 2021年1月28日 |
| 出願国 | 世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ） |
| 国際出願番号 | 2020JP019827 |
| 国際公開番号 | WO 2020235570 |
| 国際出願日 | 令和2年5月19日(2020.5.19) |
| 国際公開日 | 令和2年11月26日(2020.11.26) |
| 優先権データ |
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| 発明の名称 （英語） |
CAPSULE PROTEIN AND MULTIMERIC COMPLEX COMPOSITION THEREOF, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION USING SAME
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| 発明の概要（英語） | There has been an idea to pack a pharmaceutical agent in a lipocalin-type prostagladin H synthase having a barrel structure, and seal the pharmaceutical agent in the barrel structure by introducing a disulfide bond between α-helix H2 and E-F loop. However, in some cases the pharmaceutical agent is released through a gap in an opening of the barrel structure. This capsule protein is characterized in that: a cysteine, which is the active center of a human lipocalin-type prostagladin D synthetase, has been substituted with alanine; and at least one amino acid of a β strand D has been substituted with a barrier amino acid. The capsule protein has a barrier amino acid provided to the β strand D constituting the opening of the barrel structure, and as a result, the release of the pharmaceutical agent that has been packed is suppressed. |
| 従来技術、競合技術の概要（英語） |
BACKGROUND ART In DDS, the development of drug carriers is a key technique. Liposomes, microparticles, nano-related substances, drug-polymer conjugates, and the like have been investigated. Among these, polymer micelles have been focused on as favored carriers for the transmission of poorly water-soluble drugs. For example, Patent Document 1) discloses a micelle-forming composition comprising a hydrophobic core surrounded by a hydrophilic shell, wherein the hydrophilic shell comprises PVP (N-vinyl-2-pyrrolidone). Patent Document 2 discloses lipocalin type prostaglandin d synthase ((hereinafter referred to as "L-PGDS"), which is a biological product. a capsule protein modified with) discloses that the effect of a drug can be exhibited by dissolving a poorly water-soluble drug in water and administering the drug. Because the capsule protein modified with L-PGDS is an organism in vivo, it is not an antigen and is not toxic to humans, so it can be said to be a safe and reliable drug delivery device. Patent Document 3 discloses a protein in which a capsule protein modified with L-PGDS is labeled to recognize affected cells. For example, it is thought that a capsule protein modified with L-PGDS, which is labeled peptide that specifically binds to cancer cells, collects in affected cancer cells and improves the therapeutic effect. Patent Document 4 discloses a protein in which 34 th and 92 th tryptophan from the N-terminal of a capsule protein modified with L-PGDS are replaced with cysteine, and a lid made of a disulfide bond that opens and closes in an oxidation-reduction atmosphere is provided. The purpose of the present invention is to enhance the ability to retain the drug by opening and closing disulfide bonds. |
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| 国際特許分類(IPC) |
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| 指定国 |
National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JO JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN WS ZA ZM ZW ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL ST SZ TZ UG ZM ZW EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN TD TG |
日本語項目の表示
| 発明の名称 |
カプセルタンパク質とその多量体組成物およびそれを用いた医薬組成物
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| 発明の概要 | バレル構造を有するリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素に薬剤を収納し、αヘリックスＨ２とＥ－Ｆループ間にジスルフィド結合を導入して、薬剤を閉じ込めるアイデアはあったが、バレル構造の開口の隙間から薬剤が放出される場合があった。 ヒト型リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の活性中心のシステインがアラニンに置換され、βストランドＤの少なくとも１つのアミノ酸を障壁アミノ酸に置換されたことを特徴とするカプセルタンパク質は、バレル構造の開口を構成するβストランドＤに設けた障壁アミノ酸によって、収納した薬剤の放出が抑制される。 |
| 特許請求の範囲 |
[請求項1] ヒト型リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の活性中心のシステインがアラニンに置換され、βストランドＤの少なくとも１つのアミノ酸を障壁アミノ酸に置換されたことを特徴とするカプセルタンパク質。 [請求項2] Ｅ－ＦループとαヘリックスＨ２との間にジスルフィド結合を導入したことを特徴とする請求項１に記載されたカプセルタンパク質。 [請求項3] 前記カプセルタンパク質のＮ末端若しくはＣ末端に標識ペプチドが結合されたことを特徴とする請求項１または２に記載されたカプセルタンパク質。 [請求項4] 前記障壁アミノ酸が、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）の内から選択された少なくとも１つのアミノ酸であることを特徴とする請求項１乃至３の何れか一の請求項に記載されたカプセルタンパク質。 [請求項5] 前記カプセルタンパク質を複数個結合させたことを特徴とするカプセルタンパク質の多量体組成物。 [請求項6] 前記多量体組成物が４量体若しくは８量体であることを特徴とする請求項５に記載されたカプセルタンパク質の多量体組成物。 [請求項7] 前記多量体組成物が、ストレプトアビジンの４量体にビオチンを介して前記カプセルタンパク質が結合されたことを特徴とする請求項６に記載されたカプセルタンパク質の多量体組成物。 [請求項8] 請求項１乃至７の何れか一の請求項に記載された前記カプセルタンパク質に薬剤を含ませた医薬組成物。 [請求項9] 凍結乾燥されたことを特徴とする請求項８に記載された医薬組成物。 [請求項10] 請求項１乃至７の何れか一の請求項に記載された前記カプセルタンパク質に薬剤以外の化合物を含ませた複合体を含有する加工食品。 |
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| 明細書 |
技術分野 [0001] 本発明は、ドラッグ・デリバリー・システム（ＤＤＳ）として利用することが可能な、カプセルタンパク質およびその多量体組成物に関するもので、特に難水溶性の薬剤を溶解でき、投与後は、患部で薬剤をリリースすることができるカプセルタンパク質およびそれを用いた医薬組成物と加工食品である。 背景技術 [0002] ＤＤＳにおいて、薬剤運搬体の開発はキーとなる技術である。従来リポソーム、微粒子、ナノ関連物質および薬物・ポリマー結合体などが検討されてきた。中でもポリマーミセルは、難水溶性薬物の伝達に有利な運搬体として注目されてきた。例えば、親水性シェルに囲まれた疎水性コアからなるミセル形成組成物であって、親水性シェルがＰＶＰ（Ｎ－ビニル－２－ピロリドン）からなるもの（特許文献１）がある。 [0003] 特許文献２には、生体産生物であるリポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（以後「Ｌ－ＰＧＤＳ」という。）を修飾したカプセルタンパク質が難水溶性の薬剤を水に溶かし、投与することで薬剤の効果を発揮させることができることが開示されている。Ｌ－ＰＧＤＳを修飾したカプセルタンパク質は、体内産生物であるため、抗原となることがなく、またヒトにとっては毒物でもないため、安全で確実な薬剤運搬体といえる。 [0004] 特許文献３には、Ｌ－ＰＧＤＳを修飾したカプセルタンパク質に患部の細胞を認識させる標識をつけたタンパク質が開示されている。例えば癌細胞に特異的に結合する標識ペプチドをつけたＬ－ＰＧＤＳを修飾したカプセルタンパク質は、患部の癌細胞に集まり、治療の効果が向上すると考えられる。 [0005] 特許文献４には、Ｌ－ＰＧＤＳを修飾したカプセルタンパク質のＮ末端から３４番目および９２番目のトリプトファンをシステインに置き換えて、酸化還元雰囲気で開閉するジスルフィド結合による蓋を設けたタンパク質が開示されている。開閉するジスルフィド結合によって、薬剤の保持能力を高める目的である。 先行技術文献 特許文献 [0006] 特許文献1 : 特表２００４－５０１１８０号公報 特許文献2 : 特開２００８－１２０７９３号公報 特許文献3 : 特開２０１１－２０７８３０号公報 特許文献4 : 特開２０１３－１６２７６０号公報 発明の概要 発明が解決しようとする課題 [0007] Ｌ－ＰＧＤＳを利用したカプセルタンパク質は、難水溶性の薬剤を容易に溶解することができ、また生体産生物なので、安全性が高いという利点がある。しかし、薬剤を保持するバレル構造は蓋の無い容器様の形状をしている。したがって、一度取り込んだ薬剤が運搬中に放出されるという問題があった。この課題を解決するために、特許文献４では、ジスルフィド結合による留めをＬ－ＰＧＤＳを利用したカプセルタンパク質に施した。 [0008] しかし、ジスルフィド結合によるＬ－ＰＧＤＳを利用したカプセルタンパク質の開口部へ施す留めでは、バレル構造の開口を塞ぎきれないということが分かった。 課題を解決するための手段 [0009] 本発明は上記問題に鑑みて想到されたものであり、バレル構造の開口部に嵩高い障壁となるアミノ酸を設け、薬剤の不要な放出を防止できるカプセルタンパク質を提供する。 [0010] より具体的に本発明に係るカプセルタンパク質は、 ヒト型リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素の活性中心のシステインがアラニンに置換され、βストランドＤの少なくとも１つのアミノ酸を障壁アミノ酸に置換されたことを特徴とする。 発明の効果 [0011] 本発明に係るカプセルタンパク質は、ミュータントＬ－ＰＧＤＳのβストランドで構成されるバレル構造の開口部に障壁となるアミノ酸を設けたので、バレル構造に入った薬剤が輸送中に放出されることが少なく、効率よく薬剤を患部細胞に届けることができる。 [0012] また、本発明に係るカプセルタンパク質を多量体組成物とすることで、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果を発揮させることができ、癌細胞侵入の特異性が高くなり、薬剤の効果を高めるとともに、正常細胞への影響を抑制することができ、副作用を抑える効果を期待できる。 図面の簡単な説明 [0013] [図1] ミュータントＬ－ＰＧＤＳの結晶構造を表す図である。 [図2] ミュータントＬ－ＰＧＤＳのアミノ酸配列を表す図である。 [図3] Ｄクリップ（ジスルフィド結合）を導入したＤクリップミュータントのモデル構造を表す図である。 [図4] 障壁付アミノ酸を付与した障壁付ミュータントのモデル構造を表す図である。 [図5] 多量体組成物の概念を表す図である。 [図6] ミュータントＬ－ＰＧＤＳと標識されたミュータントＬ－ＰＧＤＳのモデル構造を表す図である。 [図7] 障壁付Ｄクリップミュータントと標識された障壁付Ｄクリップミュータントのモデル構造を表す図である。 [図8] カプセルタンパク質にＳＮ－３８を含ませた時の保持力と放出能を調べたグラフである。 [図9] カプセルタンパク質（障壁付ミュータント）にＳＮ－３８を含ませた時の保持力と放出能を調べたグラフである。 [図10] カプセルタンパク質（障壁付ミュータント）にジピリダモールを含ませた時の保持力を調べたグラフである。 [図11] ヒト前立腺癌を発生させたマウスにＳＮ－３８を含ませたカプセルタンパク質を投与した時の腫瘍成長抑制能を調べたグラフである。 [図12] ヒト前立腺癌を発生させたマウスにＳＮ－３８を含ませたカプセルタンパク質の八量体組成物を投与した時の腫瘍成長抑制能を調べたグラフである。 [図13] 図１２のマウスの体重変化を示すグラフである。 発明を実施するための形態 [0014] 以下に本発明に係るカプセルタンパク質について図面および実施例を示し説明を行う。なお、以下の説明は、本発明の一実施形態および一実施例を例示するものであり、本発明が以下の説明に限定されるものではない。以下の説明は本発明の趣旨を逸脱しない範囲で改変することができる。 [0015] 本発明に係るカプセルタンパク質はヒト型リポカリン型プロスタグランジンＤ合成酵素（Ｌ－ＰＧＤＳ）を基とする。表１には、Ｌ－ＰＧＤＳのアミノ酸配列（配列番号１）を示す。Ｌ－ＰＧＤＳは、Ｎ末端のアラニンから１６８番目のグルタミンまでの１６８個のアミノ酸によって構成されている。 [0016] [表1] [0017] 大腸菌を形質変化させて得たＬ－ＰＧＤＳを、「ミュータントＬ－ＰＧＤＳ」若しくは単に「ミュータント」と呼ぶ。表２には、ミュータントＬ－ＰＧＤＳのアミノ酸配列（配列番号２）を示す。人工的に作製する都合上Ｎ末端には、グリシン－セリン（ＧＳ）が付加され、表１の場合と比較して２つアミノ酸が増えている。以後ミュータントＬ－ＰＧＤＳのアミノ酸を指定する場合は、Ｌ－ＰＧＤＳの配列のＮ末端にグリシン－セリン（ＧＳ）が付加された配列で示す。 [0018] [表2] [0019] ミュータントＬ－ＰＧＤＳは、酵素活性点を失活させるため、Ｎ末端から４５番目（配列番号１では４３番目）のシステイン（Ｃ）をアラニン（Ａ）に置換されている。また、間違ってジスルフィド結合の掛け違えが生じないために１４７番目（配列番号１では１４５番目）のシステイン（Ｃ）もアラニン（Ａ）に置換されている。表２（以下のカプセルタンパク質の配列でも同様。）では、この２か所を四角で囲った。このミュータントＬ－ＰＧＤＳを「Ｃ４５Ａ／Ｃ１４７Ａ」とも呼ぶ。 [0020] 図１には、ミュータントＬ－ＰＧＤＳの結晶構造を示す。図１（ａ）を９０°回転させた状態を図１（ｂ）に示す。なお、Ｌ－ＰＧＤＳも同じ形状をしている。また、図２には、ミュータントＬ－ＰＧＤＳ（Ｃ４５Ａ／Ｃ１４７Ａ）のアミノ酸配列（配列番号２）とβストランドおよびαヘリックスの対応を示す。 [0021] ミュータントＬ－ＰＧＤＳは、符号ＡからＨまでの８本のβストランドと、符号Ｈ１から符号Ｈ３のαヘリックスを有する。なお、βストランド間にはループが存在し、短いストランドＩと短いヘリックスＨ４、Ｈ５が存在する。 [0022] βストランドＡからβストランドＨまでが、中心部に空間を包むように螺旋様に配置されている。これをバレル構造と呼ぶ。ミュータントＬ－ＰＧＤＳが薬剤を保持する際には、このバレル構造内に薬剤を収納すると考えられる。また、図１（ｂ）を参照して、βストランドＤとαヘリックスＨ２の間にバレル構造に対する大きな開口１０が形成される。 [0023] 開口１０が開いたままであると、一度薬剤が収納されても、所定の細胞に届く前に放出されてしまうおそれが高い。そこで、開口１０に蓋を設ける（特許文献４）。これには、βストランドＥとβストランドＦをつなぐループ（「Ｅ－Ｆループ」と呼ぶ。）と、αヘリックスＨ２の間にジスルフィド結合を生じさせる。 [0024] 図２を再度参照して、Ｅ－ＦループはミュータントＬ－ＰＧＤＳのＮ末端から９０番目のプロリン（Ｐ）から９３番目のグリシン（Ｇ）までの４つのアミノ酸である。また、αヘリックスＨ２は、同様にＮ末端から３２番目のセリン（Ｓ）から４１番目のアラニン（Ａ）までの１０個のアミノ酸である。ジスルフィド結合はこれらの内の１つずつをシステイン（Ｃ）に変更することで得ることができる。これを「ジスルフィドクリップ」若しくは「Ｄクリップ」と呼ぶ。 [0025] 例えば、図３には、αヘリックスＨ２のリシン（Ｎ末端から３８番目のＫ）と、Ｅ－Ｆループのヒスチジン（Ｈ）をそれぞれシステイン（Ｃ）に置換したミュータントＬ－ＰＧＤＳのモデル構造を示す。システイン（Ｃ）同士で形成されたジスルフィドクリップ１２によって、開口１０の一部が閉じられているのがわかる。このミュータントＬ－ＰＧＤＳを「Ｄクリップミュータント」と呼ぶ。特許文献４には、Ｄクリップミュータントが開示されている。 [0026] しかし、ジスルフィドクリップ１２は開口１０の端部をクリップするにとどまり、バレル構造内部に収納した薬剤がジスルフィドクリップ１２とβストランドＤとの隙間１４から放出されることが分かった。そこで、βストランドＤ上の隙間１４を塞ぐために、本発明では、障壁アミノ酸を設ける。障壁アミノ酸とは、開口１０の面積を減らすことができるアミノ酸をいう。障壁アミノ酸を設けることで、隙間１４を塞ぐだけでなく、開口１０をも効果的に狭くすることが可能となる。 [0027] 再度図２を参照すると、βストランドＤは、ミュータントＬ－ＰＧＤＳのＮ末端から６８番目のグルタミン（Ｑ）から７８番目のプロリン（Ｐ）までの１１個のアミノ酸配列である。障壁アミノ酸は、空間的に広い範囲を占める官能基を持つことが望ましい。隙間１４をできるだけ塞ぐためである。また、βストランドＤ上に障壁アミノ酸を導入することで、ミュータントＬ－ＰＧＤＳの結晶構造が大きく変化しないことが必要である。バレル構造を維持する必要があるからである。 [0028] 例えば、障壁アミノ酸は、リシン（Ｋ）、ヒスチジン（Ｈ）、トリプトファン（Ｗ）、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）などが好適に利用できる。また、置換は１か所でなくてもよい。また、障壁アミノ酸は、βストランドを構成するアミノ酸配列に挿入してもよい。 [0029] 図４には、βストランドＤ上のメチオニン（Ｍ：Ｎ末端から７４番目、図２参照）をトリプトファン（Ｗ）に置換したミュータントＬ－ＰＧＤＳのモデル構造を示す。図では「７４Ｗ」と示した。βストランドＤ上にトリプトファンが配置されることで、隙間１４が塞がれている状態を示す。このように障壁アミノ酸を設けたミュータントＬ－ＰＧＤＳを「障壁付ミュータント」と呼ぶ。 [0030] なお、障壁付ミュータントには、ジスルフィドクリップを設けることもできる。障壁アミノ酸とジスルフィドクリップを共に設けたミュータントＬ－ＰＧＤＳを「障壁付Ｄクリップミュータント」と呼ぶ。 [0031] さらに、特許文献３に示したように、標的細胞を認識するペプチド（標識ペプチド）をＮ末端若しくはＣ末端あるいは両末端に付加することもできる。また、末端部分に付加するだけでなく、一部をオーバーラップさせてもよい。標識ペプチドは特に限定されるものではないが、例えば、新生血管内皮細胞に発現する膜蛋白質（ＣＤ１３）に対して特異的に結合するペプチド配列ＮＧＲを選択することができる。また、αｖβ３およびαｖβ５インテグリンを認識するｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ｉＲＧＤ）モチーフでもよいし、ニューロフィリン１を認識するＣｙｓ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ（ＣＲＧＤＫ）モチーフでもよい。 [0032] また、胃がんの腹膜腫瘍を認識するＬｙｓ－Ｌｅｕ－Ｐｒｏ（ＫＬＰ）モチーフ（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， ９７， １０７５－８１， ２００６）、転移性がん細胞を認識するＡｓｎ－Ｖａｌ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｇｌｎ （ＮＶＶＲＱ）モチーフ（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ， １４， ５４９４－５０２， ２００８）、肝がん細胞を認識するＰｈｅ－Ｇｌｎ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｓｅｒ－Ｐｈｅ－Ｉｌｅ（ＦＱＨＰＳＦＩ）モチーフ（Ｍｏｌ Ｍｅｄ， １３， ２４６－５４， ２００７）等も好適に利用できる。 [0033] 本発明に係るカプセルタンパク質である障壁付ミュータントに標識ペプチドを付加したものを、「標識された障壁付ミュータント」と呼ぶ。また、ジスルフィドクリップも付加したものを、「標識された障壁付Ｄクリップミュータント」と呼ぶ。また、本発明に係るカプセルタンパク質には、遺伝子組み換えによる作製上の利便性のために、上記のＧＳ以外にもＮ末端若しくはＣ末端に複数のアミノ酸が結合してもよい。 [0034] 本発明に係るカプセルタンパク質は、およそ８００Ｄａ程度まで大きさの化合物をバレル構造に取り込むことができる。ここで化合物とは、薬剤やその他の化合物であってよい。ここで、その他の化合物とは、補助栄養となる化合物や、天然物由来の化合物であってもよい。 [0035] また、ＤＤＳでは、ＥＰＲ（Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）効果によって、癌細胞中への侵入の選択性が高くなるとともに、残留期間を長くし、長期間に亘って薬剤効果を期待できることが知られている。したがって、本発明に係るカプセルタンパク質である障壁付ミュータントを多量体組成物にして用いてもよい。なお、ＥＰＲ効果を期待するためには、全体の大きさを、１０ｎｍ以上の大きさにするのがよいとされる。また、多量体組成物に標識ペプチドを付加してもよい。 [0036] カプセルタンパク質を多量体組成物にする場合は、複数のカプセルタンパク質のＣ末端とＮ末端同士を結合し、直線的に連結した多量体組成物が好適に利用することができる。しかし、放射状にカプセルタンパク質を連結できればより好ましい。図５に本発明で採用したカプセルタンパク質の多量体組成物の構造の概念図を示す。 [0037] 図５（ａ）にカプセルタンパク質の多量体組成物（以下単に「多量体組成物」と呼ぶ。）の概念図を示す。図５（ｂ）は、多量体組成物２１の一部分解図である。多量体組成物２１は、ストレプトアビジン３０の四量体３２に、リンカー３５で結合されたカプセルタンパク質３４の二量体３６が、ビオチン３８によって結合した形をしている。したがって、多量体組成物２１はカプセルタンパク質３４の八量体組成物を形成している。 [0038] カプセルタンパク質３４はミュータントＬ－ＰＧＤＳ、若しくは障壁付ミュータントが好適に利用できる。ここでは、障壁付ミュータントを用いた場合を説明する。 [0039] ビオチン３８とストレプトアビジン３０の結合における解離定数（Ｋｄ）は１０ －１５Ｍと、既知のタンパク質とリガンド間の非共有結合性相互作用の中では最も強力である。また、この相互作用は、非常に迅速に形成され、形成後はｐＨ、温度、変性剤、および有機溶媒等の影響を受けにくい。また、ビオチンは低分子であるため、修飾した分子の機能性を阻害しない。したがって、図５（ａ）に示した八量体は、非常に安定に存在すると考えられる。 [0040] なお、図５（ｃ）には、ストレプトアビジン３０の四量体３２に、ビオチン３８を介してカプセルタンパク質３４の単量体が結合した多量体組成物２２を示す。これはカプセルタンパク質３４の四量体を形成している。 [0041] 後述するように、カプセルタンパク質３４の八量体の多量体組成物２１は、直径が１０ｎｍ以上あり、四量体や単量体と比較して大きい。このため、正常細胞と比較して内皮細胞間に大きな隙間が生じている癌細胞中の血管からは癌細胞内に入ることができるが、正常細胞には透過漏出しにくい。したがって、癌細胞に選択的に侵入し内部に残留する、所謂ＥＰＲ効果を発揮する。 [0042] 本発明に係る多量体組成物２１（カプセルタンパク質３４が八量体を形成しているもの）は、カプセルタンパク質の単量体とは、明らかに異なる効果を後述するｉｎ ｖｉｖｏの実験で示しており、ＥＰＲ効果を発揮していると考えられる。 [0043] カプセルタンパク質は、薬剤やその他の化合物を取り込んだうえで、可溶性となる。多量体組成物としてもその作用は変わらない。したがって、カプセルタンパク質は、難溶性の薬剤や、難溶性のビタミン等を可溶化するのに好適に利用できる。例えば、ＳＮ－３８や、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、Ｋ、甲状腺ホルモン類、ステロイドホルモン類、イソフラボン類等が好適に利用できる。また、難溶性の物質を可溶化することができるため、薬剤開発において可溶化というハードルを低下させることができる。 [0044] 本発明に係るカプセルタンパク質に薬剤を含有させた医薬組成物（以下単に「医薬組成物」と呼ぶ。）は、液体状で提供することができる。また、凍結乾燥することで、粉末として提供することもできる。凍結乾燥した場合にも効果が維持されることは特許文献３に示す通りである。 [0045] したがって、本発明に係る医薬組成物を、治療に使用する場合に、経口的または非経口的（例えば、静脈内、皮下、もしくは筋肉内注射、局所的、経直腸的、経皮的、または経鼻的）に投与することができる。経口投与のための組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、丸剤、顆粒剤、散剤、液剤、懸濁剤などが挙げられる。 [0046] また、非経口投与のための組成物としては、例えば、注射用水性剤、もしくは油性剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、エアロゾル剤、坐剤、貼付剤などが挙げられる。これらの製剤は、従来公知の技術を用いて調製され、製剤分野において通常使用される無毒性かつ不活性な担体もしくは賦形剤を含有することができる。 [0047] また、カプセルタンパク質に薬剤若しくは薬剤以外の化合物を取り込ませた複合体を、加工食品として提供することも可能である。加工食品としては、例えば、飴、ガム、ゼリー、ビスケット、クッキー、煎餅、パン、麺、魚肉・畜肉練製品、茶、清涼飲料、コーヒー飲料、乳飲料、乳清飲料、乳酸菌飲料、ヨーグルト、アイスクリーム、プリン等といった嗜好食品や健康食品を含む一般加工食品だけでなく、厚生労働省の保健機能食品制度に規定された特定保健用食品や栄養機能食品などの保健機能食品を含み、さらに、栄養補助食品（サプリメント）、飼料、食品添加物等も加工食品に含まれる。さらに、難溶性物質を可溶性にする性質を利用し、工業製品や工業素材として用いてもよい。 [0048] これらの加工食品の原料中に、その他の化合物を含有させたカプセルタンパク質（複合体）を添加することで、本発明に係る加工食品を調製することができる。なお、カプセルタンパク質は、タンパク質である障壁付ミュータントがその他の化合物を包んでいるので、熱で分解しやすい。したがって、本発明に係る加工食品では、複合体添加後には、加熱工程が加わらない工程で完成させるのが望ましい。 実施例 [0049] サンプル用のカプセルタンパク質として、 （１）ミュータントＬ－ＰＧＤＳ （２）標識されたミュータントＬ－ＰＧＤＳ （３）障壁付Ｄクリップミュータント （４）標識された障壁付Ｄクリップミュータント の４種類を作製した。 [0050] ミュータントＬ－ＰＧＤＳは、配列番号２に示したカプセルタンパク質で、Ｎ末端から４５番目のシステイン（Ｃ）をアラニン（Ａ）に置換され、１４７番目のシステイン（Ｃ）をアラニン（Ａ）に置換されたもの（「Ｃ４５Ａ／Ｃ１４７Ａ」）である。ミュータントＬ－ＰＧＤＳは、活性点を失活させ、作製の過程で間違ったジスルフィド結合が生じないように１４７番目のシステイン（Ｃ）をアラニン（Ａ）に置換されたものである。 [0051] 標識されたミュータントＬ－ＰＧＤＳは、ミュータントＬ－ＰＧＤＳに、標識として、腫瘍への集積と細胞膜透過を同時に可能にするｉＲＧＤペプチド（ＣＲＧＤＫＧＰＤＣ：配列番号３）をＣ末端に付加したものである。ただし、ミュータントＬ－ＰＧＤＳのＣ末端の一部とオーバーラップさせて付加した。これは後にマウスでのｉｎ ｖｉｖｏの実験において、マウスへの抗原性を解消するためのものである。標識されたミュータントＬ－ＰＧＤＳのアミノ酸配列を配列番号４として表４に示す。標識ペプチドの部分は「■」で示した。なお、図６に、ミュータントＬ－ＰＧＤＳと標識されたミュータントＬ－ＰＧＤＳのモデル構造を示す。 [0052] [表3] [0053] [表4] [0054] 障壁付Ｄクリップミュータントは、まず障壁アミノ酸として、βストランドＤ上のメチオニン（Ｍ）をトリプトファン（Ｗ）に置換した。メチオニンは、ミュータントＬ－ＰＧＤＳのＮ末端から７４番目である。 [0055] 障壁付Ｄクリップミュータントは、さらにＤクリップを付加したものである。Ｄクリップは、ミュータントＬ－ＰＧＤＳのＮ末端から３８番目のリシン（Ｋ）をシステイン（Ｃ）に置換し、９１番目のヒスチジン（Ｈ）をシステイン（Ｃ）に置換したものである。アミノ酸配列を表５（配列番号５）に示す。表５において、障壁アミノ酸は「▲」で示し、Ｄクリップ（ジスルフィド結合）は「★」で示した。「★」で示した２つのシステイン（Ｃ）の間でジスルフィド結合が生じる。なお、ジスルフィド結合は還元環境では、結合が離れるので、Ｄクリップで開口１０を閉じたり開いたりできる。 [0056] [表5] [0057] 標識された障壁付Ｄクリップミュータントは、障壁付Ｄクリップミュータント（配列番号５）にｉＲＧＤペプチド（ＣＲＧＤＫＧＰＤＣ）をＣ末端にオーバーラップして付加したものである。表６に配列番号６を示す。、障壁アミノ酸は「▲」で示し、Ｄクリップ（ジスルフィド結合）は「★」で示した。また、標識ペプチドの部分は「■」で示した。また、図７に障壁付Ｄクリップミュータントと標識された障壁付Ｄクリップミュータントのモデル図を示す。 [0058] [表6] [0059] それぞれのカプセルタンパク質は、設計された発現プラスミドを、メガプライマー法により作製した後、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ－ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅとの融合タンパク質として発現させた。 [0060] タンパク質発現株をＬＢ／Ａｍｐ試験管培地にて、３７℃条件下で８時間振盪培養した後、２×ＹＴ／Ａｍｐ ａｕｔｏ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ培地に植継ぎ、３７℃で１６時間振盪培養した。得られた菌体を超音波破砕し、破砕液上清をＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂカラムに供し、アフィニティークロマトグラフィーを行った。 [0061] カラムに吸着した融合タンパク質に対して１６５ｕｎｉｔｓのｔｈｒｏｍｂｉｎで一晩反応させ、目的タンパク質を溶出し、精製した。 [0062] 次に、これらのカプセルタンパク質にＳＮ－３８を含有させた。ＳＮ－３８は、難水溶性抗癌剤である７－ｅｔｈｙｌ－１０－ｈｙｄｒｏｘｙｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎの略称である。現在臨床で用いられているＳＮ－３８のプロドラッグであるイリノテカン塩酸塩と比較して低用量で高い抗腫瘍効果を示すことが知られている。 [0063] ＜薬剤放出能＞ ＳＮ－３８濃度５０μＭ、カプセルタンパク質濃度５０μＭに調整したＳＮ－３８／ミュータントＬ－ＰＧＤＳ、およびＳＮ－３８／障壁付Ｄクリップミュータント、ＳＮ－３８／標識された障壁付Ｄクリップミュータント、それぞれ５ｍＬを透析膜（Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｍｅｍｂｒａｎｅ， Ｓｉｚｅ ２７ Ｗａｋｏ 分画分子量：１４，０００）を用い、１５０ｍＬのＰＢＳを外液として３７℃のインキュベータ内で７２時間透析した。 [0064] 透析開始後０、１、３、６、８、１２、２４、３６、４８、６０、７２時間において外液を５００μＬサンプリングし、代わりに同量のＰＢＳを加えた。サンプリングした外液中のＳＮ－３８濃度を分光蛍光光度計Ｆ－７０００（ＨＩＴＡＣＨＩ）を用いて測定した（励起波長：３６５ｎｍ、測定波長：３８０－６００ｎｍ、測定温度：３７℃）。 [0065] 次に、障壁付Ｄクリップミュータント、および標識された障壁付Ｄクリップミュータントの還元環境に応答した薬剤放出機能を前述と同様に平衡透析法により評価した。外液としてＰＢＳ、および１０ｍＭ ＤＴＴ／ＰＢＳを用いて透析を行い、外液がＰＢＳの場合を酸化環境、ＤＴＴを添加した場合を還元環境とした。 [0066] 透析外液中の経時的なＳＮ－３８濃度変化を透析時間に対してプロットした結果を図８に示す。横軸は反応時間（時間）であり、縦軸はＳＮ－３８濃度（ｎＭ）である。エラーバーは平均±標準誤差（ｎ＝３）を示す。また、図中の略語で、「ＳＮ－３８／Ｌ－ＰＧＤＳ（「●」）」は、ＳＮ－３８／ミュータントＬ－ＰＧＤＳを示し、「ＳＮ－３８／Ｃａｐｓｕｌｅ（▲）」は、ＳＮ－３８／障壁付Ｄクリップミュータントを示し、「ＳＮ－３８／Ｃａｐ－ｓＣＲＧＤＫ（■）」は、ＳＮ－３８／標識された障壁付Ｄクリップミュータントを表す。なお、「ＳＮ－３８／Ｃａｐｓｕｌｅ」および「ＳＮ－３８／Ｃａｐ－ｓＣＲＧＤＫ」において、「＋１０ｍＭ ＤＴＴ（「△」および「□」）」とあるのは、それぞれの医薬組成物溶液中に１０ｍＭのＤＴＴを添加した場合である。ＤＴＴ（Ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ：ジチオスレイトール）の添加により溶液は強い還元環境になる。 [0067] 図８を参照して、外液がＰＢＳの場合、透析開始から全ての時間において、障壁付Ｄクリップミュータント（ＳＮ－３８／Ｃａｐｓｕｌｅ）、および標識された障壁付Ｄクリップミュータント（ＳＮ－３８／Ｃａｐ－ｓＣＲＧＤＫ）における外液のＳＮ－３８濃度は、ミュータントＬ－ＰＧＤＳ（ＳＮ－３８／Ｌ－ＰＧＤＳ）と比較して低いことが明らかとなり、ＳＮ－３８／障壁付Ｄクリップミュータント、およびＳＮ－３８／標識された障壁付ＤクリップミュータントからのＳＮ－３８の放出は、ＳＮ－３８／ミュータントＬ－ＰＧＤＳからの放出と比較して抑制されていることが判明した。 [0068] 一方、外液がＤＴＴ／ＰＢＳの場合において、障壁付Ｄクリップミュータント（ＳＮ－３８／Ｃａｐｓｕｌｅ：「△」）、および標識された障壁付Ｄクリップミュータント（ＳＮ－３８／Ｃａｐ－ｓＣＲＧＤＫ：「□」）は、ＰＢＳの場合と比較して、外液のＳＮ－３８濃度が上昇した。 [0069] 以上のことから、障壁付Ｄクリップミュータント、および標識された障壁付Ｄクリップミュータントは酸化環境において、ミュータントＬ－ＰＧＤＳより長時間ＳＮ－３８を保持し、還元環境に応答してＳＮ－３８を放出することが示された。また、障壁付Ｄクリップミュータント、および標識された障壁付Ｄクリップミュータントにおいて、薬剤放出様式に差がなかったことから、標識ペプチド付加による薬剤放出制御への影響はないことが示された。 [0070] 次に、Ｄクリップのない、障壁付ミュータント（Ｍ７４Ｗ）とミュータントＬ－ＰＧＤＳについて同様の実験を行った。ミュータントＬ－ＰＧＤＳは、図８の場合の繰り返し実験となる。結果を図９に示す。図９（ａ）は、ミュータントＬ－ＰＧＤＳの場合であり、図９（ｂ）は、障壁付ミュータント（Ｍ７４Ｗ）の場合である。図９（ａ）および図９（ｂ）を参照して、横軸は反応時間（時間）であり、縦軸はＳＮ－３８濃度（μＭ）である。 [0071] 図９（ａ）を参照して外液がＰＢＳ（黒丸「●」）の場合の反応時間に対するＳＮ－３８の濃度は図８の場合とほぼ同じであり、図８の際の実験がよく再現されていることがわかる。ミュータントＬ－ＰＧＤＳでは、外液がＤＴＴ／ＰＢＳの場合（白丸「○」）、反応時間が短いうちからＳＮ－３８の濃度が２．０μＭに達し、ほぼプラトーに達しているように観察された。 [0072] これに対して、図９（ｂ）を参照して、外液がPBSの場合（黒丸「●」）、ＳＮ－３８の濃度は、反応時間が経過しても１．０μＭより高くならず、図８で示したミュータントＬ－ＰＧＤＳ、障壁付Ｄクリップミュータントや標識された障壁付Ｄクリップミュータントの場合よりも、ＳＮ－３８の放出が抑制されていた。 [0073] 一方、外液がＤＴＴ／ＰＢＳの場合（白丸「○」）には、透析時間４８時間でＳＮ－３８濃度がおよそ２．０μＭとなった。この値は、図８で示した障壁付Ｄクリップミュータントや標識された障壁付Ｄクリップミュータントの場合とほぼ同じ濃度であった。つまり、障壁付ミュータントは、障壁付Ｄクリップミュータントや標識された障壁付Ｄクリップミュータントよりも薬剤保持能力に優れていることがわかった。また、還元雰囲気では、障壁付ミュータントは他のカプセルタンパク質同様に内包している薬剤をほぼ放出することができることも確認できた。 [0074] 次に薬剤をＳＮ－３８から難水溶性の狭心症治療薬であるジピリダモールに変更し、同様の実験を行った結果を図１０に示す。なお、外液はＰＢＳである。図１０を参照して、横軸は反応時間（時間）であり、左縦軸はジピリダモール濃度（ｎＭ）である。なお、右縦軸は左縦軸を放出レート（％）に換算した軸である。ミュータントＬ－ＰＧＤＳが、反応時間と共にジピリダモール濃度が上昇したのに対して、障壁ミュータント（Ｍ７４Ｗ）は、検出限界に近い程度しかジピリダモール濃度が上昇しなかった。 [0075] このことより、障壁付ミュータントは、内包した薬剤の保持能力に優れ、薬剤によっては、ほぼ漏らすことなく保持できることがわかった。これは、体内に入り、細胞内の還元雰囲気に到達するまでは、内包した薬剤を保持し続けることができると考えることができ、ＤＤＳとして効率が高いと言える。 [0076] ＜Ｉｎ－ｖｉｖｏによる効果＞ ４週齢の雄性ＢＡＬＢ／Ｃ－ｎｕ／ｎｕマウス（日本ＳＬＣ）を室温、１２時間明暗サイクルに管理した動物室で自由給水、給餌で１週間飼育し、馴化させた。その後、右脇腹に５×１０ ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（ＰＢＳ：マトリゲル＝１：１）のヒト前立腺癌細胞ＰＣ－３を１００μＬ皮下投与することにより、前立腺癌モデルマウスを作製した。 [0077] 腫瘍体積（近似式：｛（長径）×（短径）２｝／２より算出）が２５０ｍｍ ３に達した日を投与開始０日目とし、マウスを無作為にＰＢＳ、ＳＮ－３８／ミュータントＬ－ＰＧＤＳ（２．０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）、ＳＮ－３８／標識されたミュータントＬ－ＰＧＤＳ（２．０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）、ＳＮ－３８／障壁付Ｄクリップミュータント（２．０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）、ＳＮ－３８／標識された障壁付Ｄクリップミュータント（２．０ｍｇ／ｋｇ／ｄ）の各投与群に分類し、各サンプルを１日おきに計８回、尾静脈より投与した。なお、コントロール群にはＰＢＳだけを投与した。 [0078] 図１１にｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍実験の結果を示す。横軸は投与０日目からの経過日数（日）であり、縦軸は、腫瘍体積（ｍｍ ３）である。グラフ中の略語は以下の通りである。 ＰＢＳ：コントロール群 ＳＮ－３８／Ｌ－ＰＧＤＳ：ＳＮ－３８／ミュータントＬ－ＰＧＤＳ ＳＮ－３８／Ｌ－ＰＧＤＳ－ｓＣＲＧＤＫ：ＳＮ－３８／標識されたミュータントＬ－ＰＧＤＳ ＳＮ－３８／Ｃａｐｓｕｌｅ：ＳＮ－３８／障壁付Ｄクリップミュータント ＳＮ－３８／Ｃａｐ－ｓＣＲＧＤＫ：標識された障壁付Ｄクリップミュータント [0079] ＰＢＳ投与群においては、抗腫瘍効果は確認できず、投与開始日から腫瘍体積が増加し続けた。これに対し、ＳＮ－３８／Ｌ－ＰＧＤＳ、ＳＮ－３８／Ｌ－ＰＧＤＳ－ｓＣＲＧＤＫ、ＳＮ－３８／Ｃａｐｓｕｌｅ、およびＳＮ－３８／Ｃａｐ－ｓＣＲＧＤＫ投与群においては顕著な腫瘍成長の抑制が確認された。 [0080] また、ＳＮ－３８／Ｃａｐｓｕｌｅ、およびＳＮ－３８／Ｌ－ＰＧＤＳ－ｓＣＲＧＤＫ投与群において、ＳＮ－３８／Ｌ－ＰＧＤＳ投与群と比較して有意な腫瘍成長の抑制は見られなかった。このことから、標的化、および放出制御機能のどちらか一方のみを付加した場合、ミュータントＬ－ＰＧＤＳと比較して有意に高い抗腫瘍活性は得られないことが判明した。 [0081] 一方、ＳＮ－３８／Ｃａｐ－ｓＣＲＧＤＫ（標識された障壁付Ｄクリップミュータント）は、ＳＮ－３８／Ｌ－ＰＧＤＳ（ミュータントＬ－ＰＧＤＳ）と比較して、有意に高い抗腫瘍活性を示した。以上の結果から、薬剤放出制御機能（障壁アミノ酸およびＤクリップ）、および癌標的化機能（標識ペプチド）の２つの機能の相乗効果により、腫瘍成長を有意に抑制できることが明らかとなった。 ＜多量体＞ [0082] 次にカプセルタンパク質の多量体組成物（八量体組成物）の作成を説明する。図５で説明したように、八量体組成物は、ストレプトアビジン３０の四量体３２に、リンカー３５で結合されたカプセルタンパク質３４の二量体３６が、ビオチン３８によって結合した形をしている。 [0083] したがって、カプセルタンパク質の二量体にビオチンが結合したビオチン化二量体組成物を産生した後、別途産生したストレプトアビジンの四量体と結合してカプセルタンパク質の八量体組成物を得る。なお、リンカーは表７に示す塩基配列（配列番号７）でコードされる。また、ストレプトアビジンは表８に示す塩基配列（配列番号８）でコードされる。 [0084] [表7] [0085] [表8] [0086] ＜二量体Ｌ－ＰＧＤＳ発現ベクターの作製＞ 障壁付ミュータントの遺伝子配列を、Ｂａｍ ＨＩ認識部位を含むＦｏｒｗａｒｄプライマー、およびＥｃｏ ＲＩ認識部位とリンカー配列（ＧＧＧＧＳ：配列番号７）を含むＲｅｖｅｒｓｅプライマーを用いてＰＣＲにより増幅し、アガロースゲル電気泳動を行った。これをＢａｍ ＨＩ、およびＥｃｏ ＲＩを用いて制限酵素処理したものを障壁付ミュータントインサートとした。 [0087] なお、障壁付ミュータントは、Ｎ末端から４５番目のシステイン（Ｃ）がアラニン（Ａ）に置換され、１４７番目のシステイン（Ｃ）がアラニン（Ａ）に置換され（「Ｃ４５Ａ／Ｃ１４７Ａ」）、さらに、障壁アミノ酸として、βストランドＤ上のメチオニン（Ｍ）がトリプトファン（Ｗ）に置換された（「Ｍ７４Ｗ」）したものである。メチオニンは、ミュータントＬ－ＰＧＤＳのＮ末端から７４番目である。障壁付ミュータントのアミノ酸配列（配列番号９）を表９に示す。 [0088] [表9] [0089] また、同じように制限酵素処理したプラスミド（ｐＧＥＸ４Ｔ－２）を用意した。障壁付ミュータントインサートおよび制限処理されたｐＧＥＸ４Ｔ－２を、別々にアガロースゲル電気泳動を行った。 [0090] それぞれをエチジウムブロマイド染色した後、切り出したゲルよりＡｇａｒｏｓｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｊｅｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてそれぞれのＤＮＡを抽出し、ライゲーションを行った。この操作で、障壁付ミュータントとリンカーが結合されたものをコードする塩基配列がプラスミドｐＧＥＸ４Ｔ－２に挿入された。このプラスミドを障壁付ミュータント発現ベクターと呼ぶ。 [0091] 得られた障壁付ミュータント発現ベクターを用いて大腸菌ＤＨ５α（ＤＥ３）株を形質転換し、ＬＢ／Ａｍｐプレート培地に植菌した。プレート培地に生えたコロニーに関してコロニーダイレクトＰＣＲを行った。障壁付ミュータントの存在が確認できたコロニーをＬＢ／Ａｍｐ試験管培地（５ｍＬ）に植菌し、３７°Ｃで１６時間培養した。その後、ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ（ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてミニプレップを行い、障壁付ミュータント発現ベクターを精製した。 [0092] 得られた障壁付ミュータント発現ベクターのシークエンシングを行い、障壁付ミュータントとリンカーをコードする塩基配列が挿入されていることを確認した。 [0093] この障壁付ミュータント発現ベクターに、Ｅｃｏ ＲＩおよびＳａｌＩ認識部位を含むプライマーを用いて増幅した障壁付ミュータントインサートを同様の手順で組み込んだ。その後同様の手順で大腸菌ＤＨ５α（ＤＥ３）株を形質転換し、培養して増幅した後、プラスミドを精製した。このプラスミドは二量体分の障壁付ミュータントをコードする塩基配列が含まれている。したがって、このプラスミドを二量体障壁付ミュータント発現ベクターと呼ぶ。得られた二量体障壁付ミュータント発現ベクターに対してシークエンシングを行い、塩基配列を確認した。 [0094] ＜修飾された二量体Ｌ－ＰＧＤＳ発現ベクターの作製＞ 次に，ビオチンリガーゼ（ＢｉｒＡ）が特異的に認識する１５アミノ酸残基（Ａｖｉｔａｇ ＴＭ、以下「Ａｖ」と呼ぶ。）をコードするように、配列番号１０および１１の相補的なオリゴＤＮＡを用いて、アニーリングを行った。ビオチンリガーゼは、ペプチドＡｖのリシン残基にビオチンを結合する。それぞれ表１０および表１１に塩基配列を示す。その後、精製用カラムＦａｓｔＧｅｎｅ Ｇｅｌ／ＰＣＲ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ （Ｎｉｐｐｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｔｏｋｙｏ）を用いてアニーリング産物を精製した。この塩基配列をＡｖ塩基配列と呼ぶ。 [0095] [表10] [0096] [表11] [0097] 二量体障壁付ミュータント発現ベクターをＢａｍ ＨＩを用いて制限酵素切断後（３７°Ｃ、３時間）、アガロースゲル電気泳動を行った。その後、二量体障壁付ミュータント発現ベクターのＤＮＡを抽出し、Ｉｎ Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標） ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）により、Ｂａｍ ＨＩの切断位置にＡｖ塩基配列を挿入した。二量体障壁付ミュータント発現ベクターにＡｖ塩基配列を挿入したものは、修飾された二量体障壁付ミュータント発現ベクターと呼ぶ。得られたベクターをシークエンシングし、目的配列の挿入を確認した。 [0098] ＜二量体障壁付ミュータント発現株＞ 修飾された二量体障壁付ミュータント発現ベクターにより、ＢｉｒＡを発現する大腸菌株ＡＶＢ１０１株を形質転換し、二量体障壁付ミュータント発現株を得た。二量体障壁付ミュータント発現株をＬＢ／Ａｍｐ／Ｃｈｌ液体培地５ｍｌに植菌し、３７°Ｃで一晩振盪培養した。次に、２×ＹＴ／Ａｍｐ／Ｃｈｌ培地１Ｌに植え継ぎ、３７°Ｃで培養した。 [0099] なお、ＢｉｒＡを発現する大腸菌株ＡＶＢ１０１株は、ＢｉｒＡをコードする塩基配列が挿入された発現ベクターが注入された大腸菌株である。 [0100] ＜ビオチン化二量体障壁付ミュータントの産生＞ 二量体障壁付ミュータント発現株の培養液のＯＤ６００の値が、０．６－１．０に達した時点で、ＩＰＴＧ（終濃度０．１ｍＭ）、およびビオチン（終濃度５０μＭ）を添加した。この操作で、大腸菌の体内で、修飾された二量体障壁付ミュータントとＢｉｒＡの両タンパク質が発現する。そして、ＢｉｒＡが、二量体障壁付ミュータントに追加されたペプチドＡｖにビオチンを結合させる。結果、二量体障壁付ミュータントのビオチン化が誘導されることとなる。 [0101] その後、３７°Ｃで６時間培養し、培養液を遠心分離（８，４００×ｇ、１０ｍｉｎ、４°Ｃ）し，菌体を回収した。さらに、菌体をＰＢＳで洗浄し、遠心分離で集菌し、菌体を超音波破砕した。 [0102] Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ＵＫ）を１５ｍｌ分注したアフィニティカラムを０．２２μｍフィルターに通したカラム体積の５倍量のＰＢＳで平衡化し、０．２２μｍフィルターに通した破砕上清液を供した。 [0103] カラム体積の３倍量の１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００／ＰＢＳ、および５倍量のＰＢＳで洗浄後、１６５ｕｎｉｔのｔｈｒｏｍｂｉｎ（ＳＩＧＭＡ）を加えてよく撹拌し、室温で１２時間以上静置した。カラム体積の５倍量のＰＢＳで溶出し、分画分子量１０ｋＤａのアミコンを用いて遠心分離（８，４００ｇ、２０ｍｉｎ、４°Ｃ）を繰り返し、４ｍｌに濃縮した。 [0104] 次に，０．２２μｍフィルターに通した５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を１０分間脱気し，２倍量の同ｂｕｆｆｅｒにより，Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６００（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ＵＫ）を平衡化した。濃縮液を０．２２μｍフィルターに通し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６００に添加した。紫外線波長２８０ｎｍの吸光度をモニターしながら、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで溶出液を１．５ｍｌずつ分画し、ビオチン化二量体Ｌ－ＰＧＤＳに相当するピークのフラクションを回収した。 [0105] 回収したフラクションをプールし、２０ｍＭ Ｎａ－ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５）にて透析後、分画分子量１０ｋＤａのアミコンを用いて遠心分離（８，４００ｇ、２０ｍｉｎ、４°Ｃ）を繰り返し、４ｍｌに濃縮した。 [0106] ＳＰ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ＵＫ）を充填したカラムに供し、２０ｍＭ Ｎａ－ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５）→１Ｍ ＮａＣｌ／２０ｍＭ Ｎａ－ａｃｅｔａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ５．５）のリニアグラジェント法を用いた陽イオン交換クロマトグラフィーを行った。 [0107] 紫外線波長２８０ｎｍの吸光度をモニターしながら、流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで溶出液を１．５ｍｌずつ分画した。その後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析を行ない、ビオチン化二量体障壁付ミュータントの単一バンドが確認されたフラクションを回収した。 [0108] ＜ストレプトアビジンの精製＞ ストレプトアビジン発現ベクター（ｐＥＴ２１ａ－Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ－Ａｌｉｖｅ， Ａｄｄｇｅｎｅ）により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、ストレプトアビジン発現株を得た。ストレプトアビジン発現株をＬＢ／Ａｍｐ液体培地５ｍｌに植菌し、３７°Ｃで一晩振盪培養した。次に、２×ＹＴ／Ａｍｐ培地１Ｌに植え継ぎ、３７°Ｃで培養した。その後、ＯＤ６００の値が０．６－１．０に達した時点で、終濃度０．１ｍＭとなる様にＩＰＴＧを添加し、発現を誘導した。さらに、１８°Ｃで２４時間培養後、培養液を遠心分離（８，４００×ｇ、１０ｍｉｎ、４°Ｃ）し、菌体を回収した。 [0109] 得られた菌体にＰＢＳを加え懸濁し，菌体１ｇあたり１μｌの１００ｍｇ／ｍｌのＬｙｓｏｚｙｍｅを加え、氷中において撹拌した。さらに、氷中で撹拌しながら、菌体を超音波破砕（１分 ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ，２分 ｒｅｓｔを７セット）し、砕液を遠心分離（４°Ｃ、 １５，０００ｒｐｍ）により、破砕し上清を得た。 [0110] Ｎｉ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ＵＫ）を１０ｍｌ分注したアフィニティカラムを０．２２μｍフィルターに通したカラム体積の５倍量の２０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ／２０ｍＭ Ｎａ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．０）で平衡化し、０．２２μｍフィルターに通した破砕上清液を供した。各ｉｍｉｄａｚｏｌｅ濃度（２０，５０，１００ｍＭ）の２０ｍＭ Ｎａ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ７．０）により洗浄し，３００ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ／Ｎａ－ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ （ｐＨ７．０）により溶出した。その後、分画分子量１０ｋＤａのアミコンを用いて遠心分離（８，４００ｇ、２０ｍｉｎ、４°Ｃ）を繰り返し、４ｍｌに濃縮した。 [0111] 次に、０．２２μｍフィルターに通したＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１０分間脱気し、２倍量の同ｂｕｆｆｅｒにより、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６００を平衡化した。濃縮液を０．２２μｍフィルターに通し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １６／６００に添加した。紫外線波長２８０ｎｍの吸光度をモニターしながら、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで溶出液を１．５ｍｌずつ分画し、非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によりストレプトアビジン四量体を得た。 [0112] ＜八量体組成物の作製＞ 精製した二量体障壁付ミュータント（ｉｎ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）、およびストレプトアビジン四量体（ｉｎ ＰＢＳ、ｐＨ７．４）をモル比が４：１となるように混合し、室温で１５分間静置した。その後、分画分子量５０ｋＤａのアミコンを用いて遠心分離（８，４００ｇ、２０ｍｉｎ、４°Ｃ）を繰り返し、４ｍｌに濃縮した。 [0113] 次に、０．２２μｍフィルターに通したＰＢＳ（ｐＨ７．４）を１０分間脱気し、２倍量の同ｂｕｆｆｅｒにより、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６００（ＧＥ Ｈｅｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ， ＵＫ）を平衡化した。濃縮液を０．２２μｍフィルターに通し、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １６／６００に添加した。紫外線波長２８０ｎｍの吸光度をモニターしながら、流速０．５ｍｌ／ｍｉｎで溶出液を１．５ｍｌずつ分画し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析により八量体組成物を得た。 [0114] なお、二量体障壁付ミュータント発現ベクターを作製する前の障壁付ミュータント発現ベクターをそのまま大腸菌に導入することで、障壁付ミュータントの単量体を得た。また、障壁付ミュータントにｉＲＧＤペプチドを付加した標識された障壁付ミュータントの単量体も作製した。表１２に標識された障壁付ミュータントのアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。ｉＲＧＤペプチドの付加の方法は配列番号６の場合と同じである。 [0115] [表12] [0116] また、障壁付ミュータント発現ベクターにＡｖ塩基配列を挿入した修飾された単量体障壁付ミュータント発現ベクターでＢｉｒＡを発現する大腸菌株ＡＶＢ１０１株を形質転換することで、ストレプトアビジンで４つの単量体が結合された四量体組成物を得ることもできる。 [0117] ＜八量体組成物の大きさ＞ ＜ＤＬＳによる八量体組成物の大きさ＞ [0118] ＜ＳＡＸＳによる八量体の大きさ＞ 得られた八量体組成物の大きさをＸ線小角散乱法（ＳＡＸＳ：Ｓｍａｌｌ Ａｎｇｌｅ Ｘ－ｒａｙ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）で測定した。なお、比較のためにミュータントＬ－ＰＧＤＳの大きさも測定した。 [0119] ＳＡＸＳ測定は，大型放射光施設であるＳＰｒｉｎｇ－８（兵庫，佐用郡）のビームラインＢＬ４０Ｂ２にて行った。Ｘ線波長を１．０００Ａ（オングストローム）、カメラ長を２．１９３ｍに調整し、２５ｏＣにおいて実験を行った。各測定につき２０－５０秒露光し、散乱光をＰＩＬＡＴＵＳ－２Ｍ（ＲＩＧＡＫＵ，Ｔｏｋｙｏ）を用いて検出した。 [0120] Ｘ線の散乱を最大限にするため、３．０ｍｍの厚さのサンプルセルを用い、セルの窓は０．０２ｍｍの石英板のものを使用した。測定誤差を避けるため、タンパク質試料と緩衝液を交互に測定した。セルにサンプルを２５μＬ入れて測定を行ない、測定後はセルからサンプルを除き、緩衝液で３回洗浄を行ってから次の測定を行った。 [0121] 検出器に二次元的に記録されたタンパク質試料、及び緩衝液の散乱パターンを円環平均によって一次元データに変換し、タンパク質試料のデータから緩衝液のデータを差し引いた。小角領域の散乱曲線は単分散系に対するＧｕｉｎｉｅｒ近似式によって分析した。散乱ベクトルＳとタンパク質濃度をＣの関数である散乱強度Ｉ（Ｓ，Ｃ）は、原点散乱強度Ｉ（０，Ｃ）と慣性半径Ｒ ｇ（Ｃ）（ｒａｄｉｕｓ ｏｆ ｇｙｒａｔｉｏｎ）を用いて（１）式の様に表せる。 [0122] [数1] また、ここで２θは散乱角、λはＸ線波長を表している。 [0123] 得られた散乱曲線のＧｕｉｎｉｅｒ領域より算出した慣性半径Ｒ ｇは、単量体（ミュータントＬ－ＰＧＤＳ）が１．８±０．０４ｎｍであったのに対し、八量体組成物はその約３倍である６．０±０．６９ｎｍであり、慣性半径Ｒ ｇが八量体化により増大したことが明らかとなった・各種測定結果を表１３に示す。また散乱曲線より算出した分子量（Ｍｗ ｅｘｐ）は単量体（ミュータントＬ－ＰＧＤＳ）、八量体組成物においてそれぞれ分子量の理論値（Ｍｗ ｃａｌｃ）と近い値であったことから、単量体（ミュータントＬ－ＰＧＤＳ）とほぼ同じ大きさと考えられる障壁ミュータントの八量体化は確実に行われていると判断できた。このように粒形が１０ｎｍを十分に超える大きさを有するので、八量体組成物は、ＥＰＲ効果による腫瘍集積性が期待できる。 [0124] [表13] [0125] ＜薬剤含有＞ 次に、単量体、障壁付ミュータント、標識された障壁付ミュータントおよび八量体組成物にＳＮ－３８を含有させた。ＳＮ－３８は、すでに説明したように難水溶性抗癌剤である７－ｅｔｈｙｌ－１０－ｈｙｄｒｏｘｙｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎの略称である。現在臨床で用いられているＳＮ－３８のプロドラッグであるイリノテカン塩酸塩と比較して低用量で高い抗腫瘍効果を示すことが知られている。 [0126] ３７°ＣにインキュベートしたＳＮ－３８のＰＢＳ懸濁液に、単量体（ミュータントＬ－ＰＧＤＳ）、障壁付ミュータント、標識された障壁付ミュータントまたは八量体組成物のＰＢＳ溶液を終濃度がそれぞれ１μＭ、０．２５μＭ、または０．１２５μＭとなるように加え、３７°Ｃで６時間撹拌した。撹拌終了後、遊離のＳＮ－３８を限外濾過により除去し、カプセルタンパク質に薬剤が含まれたサンプルを作製した。 [0127] ＜Ｉｎ－ｖｉｖｏによる効果＞ ４週齢の雄性ＢＡＬＢ／Ｃ－ｎｕ／ｎｕマウス（日本ＳＬＣ）を室温、１２時間明暗サイクルに管理した動物室で自由給水、給餌で１週間飼育し、馴化させた。その後、右脇腹に５×１０ ７ｃｅｌｌｓ／ｍＬ（ＰＢＳ：マトリゲル＝１：１）のヒト前立腺癌細胞ＰＣ－３を１００μＬ皮下投与することにより、前立腺癌モデルマウスを作製した。 [0128] 腫瘍体積（近似式：｛（長径）×（短径） ２｝／２より算出）が２５０ｍｍ ３に達した日を投与開始０日目とし、マウスを無作為にＰＢＳ、単量体（２．０ｍｇ ＳＮ－３８／ｋｇ／ｄ）、障壁付ミュータント（２．０ｍｇ ＳＮ－３８／ｋｇ／ｄ）、標識された障壁付ミュータント（２．０ｍｇ ＳＮ－３８／ｋｇ／ｄ）、八量体組成物（２．０ｍｇ ＳＮ－３８／ｋｇ／ｄ）の各投与群に分類し、単量体、障壁付ミュータント、標識された障壁付ミュータント、八量体組成物を、それぞれ４日おきに計４回尾静脈より投与した。なお、コントロール群にはＰＢＳだけを４日おきに計４回投与した。 [0129] 図１２にｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍実験の結果を示す。横軸は投与０日目からの経過日数（日）であり、縦軸は、腫瘍体積（ｍｍ ３）である。グラフ中の略語は以下の通りである。 ＰＢＳ：コントロール群 ＳＮ－３８／Ｌ－ＰＧＤＳ：単量体（ＳＮ－３８／ミュータントＬ－ＰＧＤＳ） ＳＮ－３８／Ｍ７４Ｗ：ＳＮ－３８／障壁付ミュータント ＳＮ－３８／Ｍ７４Ｗ－ｓＣＲＧＤＫ：ＳＮ－３８／標識された障壁付ミュータント ＳＮ－３８／Ｍ７４Ｗ－ｏｃｔａｍｅｒ：ＳＮ－３８／障壁付ミュータントの八量体組成物 図１１の場合と比べると、すべてＤクリップがついていないものである。 [0130] なお、標識された障壁付ミュータントは障壁付ミュータントのＣ末端にニューロフィリン１を認識するＣｙｓ－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ（ＣＲＧＤＫ）モチーフを追加したものである（標識番号１２）。 [0131] 図１２を参照して、ＰＢＳ投与群においては、抗腫瘍効果は確認できず、投与開始日から腫瘍体積が増加し続けた。これに対し、ＳＮ－３８／Ｌ－ＰＧＤＳ投与群は、腫瘍の増加を抑制する効果を示した。さらに、障壁付ミュータントであるＳＮ－３８／Ｍ７４Ｗは、より腫瘍の増加を抑制した。 [0132] 一方、ＳＮ－３８／Ｍ７４Ｗ－ｓＣＲＧＤＫ（標識された障壁付ミュータント（Ｄクリップはない））およびＳＮ－３８／Ｍ７４Ｗ－ｏｃｔａｍｅｒ（障壁ミュータントの八量体組成物）は、驚くべきことに実験開始から、全くといってよいほど、腫瘍成長は観察されなかった。ＳＮ－３８は癌細胞の増殖を抑制し、アポトーシスを誘導する薬剤でないことを考えると、ＳＮ－３８の効果が十分に発揮されているといえる。 [0133] また、４日おきに合計４回の投与であるにも関わらず投与を行わなかった１５日以降もしばらくは腫瘍成長を完全に抑制していた。したがって、細胞組織内に薬剤が残留し、リンパ系等による排泄も行われず、長期にわたって、薬効を発揮できるＥＰＲ効果が確認できた。 [0134] 図１３は、図１２の実験を行った際のマウスの平均体重を示すものである。横軸は投与０日目からの経過日数（日）であり、縦軸は、マウスの投与開始時の体重に対する体重比（％）である。各投与群（５匹）の平均を表している。グラフ中の略語は図１２の場合と同じである。図１２でのコントロール群であるＰＢＳ投与群は含まれていない。 [0135] 図１３を参照すると、癌細胞増加抑制に非常に効果を示した障壁付ミュータント（ＳＮ－３８／Ｍ７４Ｗ）は、２０日目には体重が８０％を下回る気配を示し、実験は中断された。失活させただけのＬ－ＰＧＤＳ（ＳＮ－３８／Ｌ－ＰＧＤＳ）が体重減少はあったものの、８０％を切ることはなかったことを考慮すると、障壁付ミュータントはＳＮ－３８（薬剤）の保持に優れ、ＳＮ－３８を通常細胞でも放出したために、副作用が生じたと考えれれる。 [0136] 一方、癌細胞増殖抑制に顕著な効果を示した標識された障壁付ミュータント（ＳＮ－３８／Ｍ７４Ｗ－ｓＣＲＧＤＫ）と障壁ミュータントの八量体（ＳＮ－３８／Ｍ７４Ｗ－ｏｃｔａｍｅｒ）は、体重減少はわずかであり、ＳＮ－３８の投与をやめた１５日以降はむしろ増加傾向ですらあった。 [0137] このことより、標識された障壁付ミュータント（ＳＮ－３８／Ｍ７４Ｗ－ｓＣＲＧＤＫ）と障壁ミュータントの八量体（ＳＮ－３８／Ｍ７４Ｗ－ｏｃｔａｍｅｒ）は、癌細胞を特異的に識別し癌細胞中で薬剤放出を行ったと考えられる。 [0138] また、多量体にすることで、ＥＰＲ効果を発揮させると、癌腫に関わらず薬剤を送り込むことができる。特に、転移した癌に対しては、転移した箇所にかかわらず、通常細胞に影響をあたえず、選択的に癌細胞だけに薬剤を注入することができ、非常に有用であると考えられる。 産業上の利用可能性 [0139] 本発明は、難溶性の薬剤やその他の化合物を包み込み、可溶体となる。そして、細胞に取り込まれた後に、細胞内の還元的環境下（細胞内の還元型グルタチオン濃度は、約０．５－１０ｍＭであり、細胞外の約１００－１０００倍の濃度である）においてジスルフィド結合が開裂し、包み込んだ薬剤若しくはその他の化合物を放出することができる。したがって、難溶性化合物のＤＤＳカプセルとして好適に利用することができる。さらに、難溶性物質を可溶性にする性質を利用し、工業製品や工業素材に用いることもできる。 符号の説明 [0140] １０ （バレル構造の）開口 １２ ジスルフィドクリップ １４ 隙間 ２１ 多量体組成物（八量体組成物） ２２ 多量体組成物（四量体組成物） ３０ ストレプトアビジン ３２ 四量体 ３５ リンカー ３４ カプセルタンパク質 ３６ 二量体 ３８ ビオチン |
『 CAPSULE PROTEIN AND MULTIMERIC COMPLEX COMPOSITION THEREOF, AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION USING SAME 』に関するお問合せ
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