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METHOD AND KIT FOR DETECTING INFLUENZA VIRUS, AND METHOD FOR DIAGNOSING INFLUENZA VIRUS INFECTION

Foreign code F210010307
File No. IP14P007
Posted date Jan 29, 2021
Country WIPO
International application number 2020JP009355
International publication number WO 2020179858
Date of international filing Mar 5, 2020
Date of international publication Sep 10, 2020
Priority data
  • P2019-039299 (Mar 5, 2019) JP
Title METHOD AND KIT FOR DETECTING INFLUENZA VIRUS, AND METHOD FOR DIAGNOSING INFLUENZA VIRUS INFECTION
Abstract As a technique for detecting an influenza virus with improved accuracy, a method for detecting an influenza virus in a biological sample by using a first probe and a second probe is provided, wherein the first probe can be decomposed with each of a neuraminidase derived from an influenza virus and a neuraminidase derived from a bacterium to generate an optically detectable single and the second probe can be decomposed with a neuraminidase derived from a bacterium to generate an optically detectable single and cannot be decomposed with a neuraminidase derived from an influenza virus.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
In recent years, see (Patent Document 1) has been developed a simple influenza virus test kit using immunochromatography. The method using immunochromatography is capable of detecting influenza virus within several minutes to several tens of minutes, and is therefore used for diagnosis and treatment of infection.
In addition, a technique for optically detecting influenza virus based on the reaction of neuraminidase (sialidase), which is an enzyme possessed by influenza virus, with a coloring substrate is conventionally known. Neuraminidase is an exo-glycolytic enzyme which liberates sialic acid from the non-reducing end of the sugar chain. Neuraminidases are present on the surface of influenza viruses and are involved in the proliferation of viruses. As the chromogenic substrate, for example, 4-methylumbelferyl-α-D-noiramic acid (4-acid: 4MU-NANA, see Patent Document 2), a chemiluminescent derivative of 4-alkoxy-N-acetylneuraminic acid or 4,7-dialkoxy-N-acetylneuraminic acid (, see Patent Document 3, and the like. For example, in a method using 4MU-NANA as a coloring substrate, 4-methylumbelliferone, which is a fluorescent substance, is produced by decomposition of 4MU-NANA by neuraminidase. The enzyme activity value of neuraminidase can be calculated on the basis of the fluorescence intensity of the generated 4-methylumbelferon, and the number of influenza virus particles can be quantified on the basis of the enzyme activity value.
Patent Document 4 discloses a kit for detecting whether influenza is human influenza or human pathogenic avian influenza in a human. The kit comprises a substrate comprising N-glycolide neuraminic (NeuGcα2-3Gal) acid bound to galactose and a substrate comprising N-acetylneuraminic acid (NeuAcα2-3Gal) bound to galactose. The 2 kinds of substrates are brought into contact with a clinical specimen, and when only the substrate based on NeuAcα 2-3Gal is cleaved, it is determined to be positive for human influenza virus, and when both the substrate based on NeuAcα 2-3Gal and the substrate based on NeuGcα 2-3Gal are cleaved, it is determined to be positive for human pathogenic avian influenza virus.
Patent Document 5 describes a method for detecting influenza virus by a digital method. In the digital method, an object to be detected is introduced into a large number of minimum spaces (, for example, minute droplets) so as to exist at a maximum of 1 molecules. Then, the object to be detected in each minimum space is detected, and its existence is digitized by 0 or 1. Thus, in the digital method, the detection object can be detected quantitatively with high sensitivity. Patent Document 6,7 describes a technique for encapsulating a substance in a minimum space (Enclose) and applicable to a digital method.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
 生物試料中のインフルエンザウイルスを検出する方法であって、
(1)前記生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順1、
 ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
 前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
 前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
(2)前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順2と、を含み、
 前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスの存在を検出し、
前記比が前記所定値未満である場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスの不存在を検出する、検出方法。

[請求項2]
 前記第二のプローブが以下の式(1)で表わされる化合物又はその塩である、請求項1記載の検出方法。

(式中、
R 1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し;
R 2及びR 3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1~6個のアルキル基又はハロゲン原子を示し;
R 4及びR 5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1~6個のアルキル基又はハロゲン原子を示し;
R 6は、水素原子、炭素数1~5個のアルキル基、又は炭素数1~5個のフッ化アルキル基を示し;
R 7及びR 8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数1~6個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Xが酸素原子の場合は、R 7及びR 8は存在せず;
R 9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数1~5個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され;
R 10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し;Xは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し;
mは、0~4の整数であり;
nは、1~3の整数であり;
sは、1の整数であり;
tは、0~4の整数である。)

[請求項3]
 前記第一のプローブが、2´-(4-メチルウンベリフェリル)-α-D-N-アセチルノイラミン酸(4MU-NANA)である、請求項1又は2記載の検出方法。

[請求項4]
 前記第一のプローブから生成する信号が検出され、前記第二のプローブから生成する信号が検出されない場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスの存在を検出し、
前記第一のプローブから生成する信号及び前記第二のプローブから生成する信号が検出された場合に、前記生物試料中のインフルエンザウイルスの不存在を検出する、請求項1-3のいずれか一項に記載の検出方法。

[請求項5]
 デジタル法に基づく、請求項1-4のいずれか一項に記載の検出方法。

[請求項6]
 インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料中のインフルエンザウイルスを検出するためのキットであって、
 インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成する第一のプローブと、
 バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されない第二のプローブと、を含み、
 前記第二のプローブが以下の式(1)で表わされる化合物又はその塩である、キット。

(式中、
R 1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し;
R 2及びR 3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1~6個のアルキル基又はハロゲン原子を示し;
R 4及びR 5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1~6個のアルキル基又はハロゲン原子を示し;
R 6は、水素原子、炭素数1~5個のアルキル基、又は炭素数1~5個のフッ化アルキル基を示し;
R 7及びR 8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数1~6個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Xが酸素原子の場合は、R 7及びR 8は存在せず;
R 9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数1~5個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され;
R 10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し;Xは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し;
mは、0~4の整数であり;
nは、1~3の整数であり;
sは、1の整数であり;
tは、0~4の整数である。)

[請求項7]
 前記第一のプローブが、2´-(4-メチルウンベリフェリル)-α-D-N-アセチルノイラミン酸(4MU-NANA)である、請求項6記載のキット。

[請求項8]
 以下の式(1)で表わされる化合物又はその塩の、インフルエンザウイルスをバクテリアと識別検出するための使用。

(式中、
R 1は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し;
R 2及びR 3は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1~6個のアルキル基又はハロゲン原子を示し;
R 4及びR 5は、それぞれ独立に、水素原子、炭素数1~6個のアルキル基又はハロゲン原子を示し;
R 6は、水素原子、炭素数1~5個のアルキル基、又は炭素数1~5個のフッ化アルキル基を示し;
R 7及びR 8は、存在する場合は、それぞれ独立に、炭素数1~6個のアルキル基又はアリール基を示し、
ここで、Xが酸素原子の場合は、R 7及びR 8は存在せず;
R 9は、各出現において独立に、水素原子、炭素数1~5個のアルキル基、アルコキシ基、水酸基、カルボキシル基、ハロゲン原子、スルホ基、アミノ基、アルコキシカルボニル基、オキソ基から選択され;
R 10は、存在する場合は、ベンゼン環上に存在する同一又は異なる一価の置換基を示し;Xは、酸素原子、珪素原子又は炭素原子を示し;
mは、0~4の整数であり;
nは、1~3の整数であり;
sは、1の整数であり;
tは、0~4の整数である。)

[請求項9]
 対象のインフルエンザウイルスへの感染の有無を診断する方法であって、
(1)インフルエンザウイルスに感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料を、第一のプローブと第二のプローブと混合する手順1、
 ここで、前記第一のプローブは、インフルエンザウイルス由来のノイラミニダーゼ及びバクテリア由来のノイラミニダーゼの双方により分解されて光学的に検出可能な信号を生成するものであり、
 前記第二のプローブは、バクテリア由来のノイラミニダーゼにより分解されて光学的に検出可能な信号を生成しかつインフルエンザ由来のノイラミニダーゼにより分解されないものであり、
 前記第一のプローブから生成する信号と前記第二のプローブから生成する信号は光学的に区別して検出可能である、と、
(2)前記第一のプローブ及び前記第二のプローブから生成する信号を検出する手順2と、を含み、
 前記第二のプローブから生成する信号の強度に対する前記第一のプローブから生成する信号の強度の比が所定値以上である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの感染を決定し、
 前記比が前記所定値未満である場合に、前記対象のインフルエンザウイルスの非感染を決定する、診断方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY
  • Inventor
  • TABATA Kazuhito
  • NOJI Hiroyuki
  • URANO Yasuteru
  • KAMIYA Mako
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JO JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN WS ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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