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METHOD OF ANALYTE ORGANISM IDENTIFICATION, INTERNAL STANDARD DNA COMPOSITION FOR USE IN THIS METHOD AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME

Foreign code F070001769
File No. F070001769
Posted date Dec 28, 2007
Country WIPO
International application number 2005JP022188
International publication number WO 2006/059717
Date of international filing Dec 2, 2005
Date of international publication Jun 8, 2006
Priority data
  • P2004-350694 (Dec 3, 2004) JP
Title METHOD OF ANALYTE ORGANISM IDENTIFICATION, INTERNAL STANDARD DNA COMPOSITION FOR USE IN THIS METHOD AND PROCESS FOR PRODUCING THE SAME
Abstract A method of organism identification according to genotype that realizes enhancement of standardization precision, consequently enhancement of identification precision. Further, there is provided means for enhancing of standardization precision. The method may comprise (1) subjecting a double stranded DNA prepared using the genome of analyte organism as a template to a temperature gradient gel electrophoresis or a denaturing gradient gel electrophoresis, (2) extracting a characteristic point of the double stranded DNA from the obtained electrophoretic pattern of the double stranded DNA, and (3) carrying out identification of the analyte organism on the basis of the extracted characteristic point. Further, the method may comprise (4) performing the above gel electrophoresis of double stranded DNA together with two types of internal standard DNAs, (5) extracting a melting start point of each of the internal standard DNAs from the obtained electrophoretic patterns of the two types of internal standard DNAs,and standardizing the above characteristic point on the basis of these melting start points as a reference point, and (6) carrying out identification of the analyte organism on the basis of the standardized characteristic point.
Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】(1)被検体生物のゲノムを鋳型として調製した2本鎖DNAを温度勾配ゲル電気泳動(TGGE)または変性剤濃度勾配ゲル電気泳動(DGGE)に付し、(2)得られた前記2本鎖DNAの電気泳動パターンから、前記2本鎖DNAの特徴点を抽出し、(3)抽出された特徴点に基づいて被検体生物の同定を行う方法であって、(4)前記2本鎖DNAのゲル電気泳動を、2種類の内部標準DNAとともに行い、(5)前記2種類の内部標準DNAの電気泳動パターンから各内部標準DNAの融解開始点を抽出し、これらの融解開始点を基準点として、前記特徴点を規格化し、かつ(6)規格化した特徴点に基づいて被検体生物の同定を行うことを特徴とする前記方法。

【請求項2】(1)前記2本鎖DNAの調製は、ランダムPCRにより行われ、1種又は2種以上の2本鎖DNAが調製される、請求項1に記載の方法。

【請求項3】ランダムPCRが、熱変性、アニーリング及び鎖伸長を繰り返し行うPCRであって、アニーリングを25℃~35℃で1~2分で行い、かつ鎖伸長を42℃~47℃で1~2分で行う請求項2に記載の方法。

【請求項4】前記2本鎖DNAの特徴点が、各2本鎖DNAの融解開始点である請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。

【請求項5】(5)で得られた規格化した特徴点群からPaSS及び/又はゲノム準距離を求め、得られたPaSS及び/又はゲノム準距離に基づいて、被検体生物の同定を行う請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。

【請求項6】2種類の内部標準DNAが、配列表に示す配列番号1~5のいずれかの配列を有する2つのDNAから選ばれる請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。

【請求項7】2種類の内部標準DNAが、配列表に示す配列番号1の配列を有するDNA及び配列番号3の配列を有するDNAの組み合わせ、または配列表に示す配列番号4の配列を有するDNA及び配列番号5の配列を有するDNAの組み合わせである、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。

【請求項8】生物の同定が、生物の種同定又は類縁性同定である請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。

【請求項9】被検体生物が微生物である請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。

【請求項10】配列表に示す配列番号1~5のいずれかの配列を有する2つのDNAを含む、被検体生物同定方法の内部標準用DNA組成物。

【請求項11】配列表に示す配列番号1の配列を有するDNA及び配列番号3の配列を有するDNAの組み合わせ、または配列表に示す配列番号4の配列を有するDNA及び配列番号5の配列を有するDNAの組み合わせを含む、被検体生物同定方法の内部標準用DNA組成物。

【請求項12】配列表に示す配列番号4の配列を有するDNA及び配列番号5の配列を有するDNAを含む内部標準用DNA組成物の製造方法であって、pBR322DNAを鋳型DNAとし、配列番号4の配列を有するDNA増幅用のプライマーセット及び配列番号5の配列を有するDNA増幅用のプライマーセットを用いてPCR反応を行うことを特徴とする方法。

【請求項13】配列番号4の配列を有するDNA増幅用のプライマーセットが、配列番号12及び配列番号13の配列を有するDNAからなり、配列番号5の配列を有するDNA増幅用のプライマーセットが、配列番号14及び配列番号15の配列を有するDNAからなる請求項12に記載の方法。

【請求項14】PCRサイクル条件として、a前熱変性(95℃,2分)、b熱変性(94℃,15秒)、cアニーリング(55℃,30秒)、d鎖伸長(72℃,30秒)、eポスト鎖伸長(72℃,30秒)を用い、かつb~dを25回繰り返す請求項12または13に記載の方法。

【請求項15】配列表に示す配列番号1の配列を有するDNAおよび配列番号3の配列を有するDNAを含む内部標準DNA組成物の製造方法であって、fd(M13)ファージDNAを鋳型DNAとし、配列番号1の配列を有するDNA増幅用のプライマーセット及び配列番号3の配列を有するDNA増幅用プライマーセットを用いてPCR反応を行うことを特徴とする方法。

【請求項16】配列番号1の配列を有するDNA増幅用のプライマーセットが、配列番号6及び配列番号7の配列を有するDNAからなり、配列番号3の配列を有するDNA増幅用のプライマーセットが、配列番号10及び配列番号11の配列を有するDNAからなる請求項15に記載の方法。

【請求項17】PCRサイクル条件として、a前熱変性(94℃,5分)、b熱変性(94℃,30秒)cアニーリング(64℃~65℃,30秒)d鎖伸長(74℃,30秒)eポスト鎖伸長(74℃,5分)を用い、かつb~dを30回繰り返す請求項15または16に記載の方法。

【請求項18】請求項10または11に記載の内部標準用DNA組成物を含む、被検体生物同定用キット。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • Japan Science And Technology Agency
  • Saitama University
  • Inventor
  • Hamano, Keiichi
  • Kozuka, Mariko
  • Mohammed, Naimuddin
  • Nishigaki, Koichi
IPC(International Patent Classification)
Specified countries AE AG AL AM AT AU AZ BA BB BE BF BG BJ BR BW BY BZ CA CF CG CH CI CM CN CO CR CU CY CZ DE DK DM DZ EC EE EG ES FI FR GA GB GD GE GH GM GN GQ GR GW HR HU ID IE IL IN IS IT JP KE KG KM KN KP KR KZ LC LK LR LS LT LU LV LY MA MC MD MG MK ML MN MR MW MX MZ NA NE NG NI NL NO NZ OM PG PH PL PT RO RU SC SD SE SG SI SK SL SM SN SY SZ TD TG TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN YU ZA ZM ZW
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