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METHOD FOR DETECTING TARGET NUCLEIC ACID WITH SPECIFIC BASE SEQUENCE AND SET OF NUCLEIC ACIDS FOR DETECTION meetings

Foreign code F080001918
File No. N081-31WO
Posted date Sep 12, 2008
Country WIPO
International application number 2006JP323031
International publication number WO 2007/058326
Date of international filing Nov 17, 2006
Date of international publication May 24, 2007
Priority data
  • P2005-332424 (Nov 17, 2005) JP
Title METHOD FOR DETECTING TARGET NUCLEIC ACID WITH SPECIFIC BASE SEQUENCE AND SET OF NUCLEIC ACIDS FOR DETECTION meetings
Abstract It is intended to provide a method for detecting a target nucleic acid with a specific base sequence existing in a sample mixture with high specificity and sensitivity by utilizing the formation of a hybrid with a complementary strand as a detection principle, and a nucleic acid for the detection. The invention relates to a set of nucleic acids for detecting a target nucleic acid with a specific base sequence comprising a photoligating nucleic acid composed of a nucleic acid (with the proviso that in the nucleic acid, a nucleic acid and a peptide nucleic acid are included) having a group represented by the formula I, II, III, IV or V described in claims at the 5 end or 3 end as a base moiety, and a photoligated nucleic acid having a base with a carbon-carbon double bond at the 3 end or 5 end as a base moiety capable of photoligating to the photoligating nucleic acid, wherein either of the photoligating nucleic acid and the photoligated nucleic acid has a labeling moiety and the other remaining nucleic acid is immobilized on a substrate, and the method for detecting a target nucleic acid with a specific base sequence by using the set of nucleic acids.
Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】塩基部分として次の式I、式II、式III、式IV又は式V:式I【化12】(ただし、式Iにおいて、ZはO又はNHを示し、X及びYの少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基及びシアノ基からなる群より選択された電子吸引性基を示し、X及びYの残りの基は水素原子を示す)式II【化13】(ただし、式IIにおいて、R1は、水素原子であり、R2及びR3の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、R2及びR3の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す)式III【化14】(ただし、式IIIにおいて、R4は、水素原子又は低級アルキル基であり、R5及びR6の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、R5及びR6の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す)式IV【化15】(ただし、式IVにおいて、R7は、水素原子又は低級アルキル基であり、R8及びR9の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、R8及びR9の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す)式V【化16】(ただし、式Vにおいて、R10は、水素原子又は低級アルキル基であり、R11及びR12の少なくとも一方は、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、低級アルケニル基、低級アルキニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、R11及びR12の残りの基は水素原子又はシアノ基を示す)で表される基を、5’末端又は3’末端に有する核酸類(ただし、核酸類には、核酸、ペプチド核酸が含まれる)からなる光連結性核酸類と、光連結性核酸類と光連結可能な塩基部分として炭素-炭素二重結合を有する塩基を、3’末端又は5’末端に有する、被光連結性核酸類と、からなり、光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちのいずれか一方が、標識部分を有し、光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの標識部分を有さない一方が、あらかじめ基材に固定化されており、光連結性核酸類と被光連結性核酸類とが、光連結されることによって、特定の塩基配列を有する標的核酸類の塩基配列と相補的な塩基配列の核酸類を生成可能であり、光連結性核酸類と被光連結性核酸類とが光連結されることによって生成可能な核酸類は、相補的二重鎖の解離する洗浄条件で洗浄可能である、特定の塩基配列の標的核酸類を検出するための核酸類セット。

【請求項2】塩基部分が式Iで表される基であり、式Iにおいて、ZがOで、Xが水素原子で、Yがカルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基又はシアノ基である、請求項1に記載の核酸類セット。

【請求項3】塩基部分が式IIで表される基であり、式IIにおいて、R2及びR3の少なくとも一方が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、R2及びR3の残りの基が水素原子である、請求項1に記載の核酸類セット。

【請求項4】塩基部分が式IIIで表される基であり、式IIIにおいて、R5及びR6の少なくとも一方が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、R5及びR6の残りの基が水素原子である、請求項1に記載の核酸類セット。

【請求項5】塩基部分が式IVで表される基であり、式IVにおいて、R8及びR9の少なくとも一方が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、R8及びR9の残りの基が水素原子である、請求項1に記載の核酸類セット。

【請求項6】塩基部分が式Vで表される基であり、式Vにおいて、R11及びR12の少なくとも一方が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基、アミド基、シアノ基及び水素原子からなる群より選択された基を示し、R11及びR12の残りの基が水素原子である、請求項1に記載の核酸類セット。

【請求項7】標識部分の標識として、ビオチン標識、色素標識(蛍光色素標識を含む)、RI標識からなる群より選択された何れかの標識を有している、請求項1~6の何れかに記載の核酸類セット。

【請求項8】光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの、あらかじめ基材に固定化された一方の核酸類が、リンカー部分を介して基材に固定化されている、請求項1~7の何れかに記載の核酸類セット。

【請求項9】リンカー部分が、ポリエチレングリコール又はアルカン類を含む、請求項8に記載の核酸類セット。

【請求項10】基材が、ガラスプレート、CPG、ポリスチレンビーズからなる群より選択された何れかである、請求項1~9の何れかに記載の核酸類セット。

【請求項11】洗浄条件として、80~100℃の範囲の洗浄温度で洗浄可能である、請求項1~10の何れかに記載の核酸類セット。

【請求項12】洗浄条件として、95~100℃の範囲の洗浄温度で洗浄可能である、請求項1~10の何れかに記載の核酸類セット。

【請求項13】洗浄条件として、変性剤を含む洗浄溶液で洗浄可能である、請求項1~12の何れかに記載の核酸類セット。

【請求項14】洗浄条件として、界面活性剤を含む洗浄溶液で洗浄可能である、請求項1~13の何れかに記載の核酸類セット。

【請求項15】炭素-炭素二重結合を有する塩基が、シトシン、チミン又はウラシルである請求項1~14の何れかに記載の核酸類セット。

【請求項16】光連結性核酸類が、オリゴヌクレオチドである請求項1~15の何れかに記載の核酸類セット。

【請求項17】光連結性核酸類が、DNAである請求項1~15の何れかに記載の核酸類セット。

【請求項18】光連結性核酸類が、RNAである請求項1~15の何れかに記載の核酸類セット。

【請求項19】光連結性核酸類が、ペプチド核酸である請求項1~15の何れかに記載の核酸類セット。

【請求項20】被光連結性核酸類が、オリゴヌクレオチドである請求項1~19の何れかに記載の核酸類セット。

【請求項21】被光連結性核酸類が、DNAである請求項1~19の何れかに記載の核酸類セット。

【請求項22】被光連結性核酸類が、RNAである請求項1~19の何れかに記載の核酸類セット。

【請求項23】被光連結性核酸類が、ペプチド核酸である請求項1~19の何れかに記載の核酸類セット。

【請求項24】光連結性核酸類と被光連結性核酸類が、同じ種類の核酸類である請求項1~23の何れかに記載の核酸類セット。

【請求項25】請求項1~24の何れかに記載の光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの、標識部分を有さない一方が、あらかじめ基材に固定化されてなり、光連結性核酸類及び被光連結性核酸類のうちの、標識部分を有する一方とともに使用される、DNAマイクロアレイ(基材上に固定化される分子として、核酸、及びペプチド核酸を含む)。

【請求項26】請求項1~25の何れかに記載の光連結性核酸類及び被光連結性核酸類と、核酸類混合物中に含まれる、特定の塩基配列を有する標的核酸類とを、ハイブリッド形成させる工程と、特定の塩基配列を有する標的核酸類を鋳型とするハイブリッド形成によって、光連結可能に隣接された光連結性核酸類と被光連結性核酸類に、光照射して光連結させ、標識部分を有する核酸類を基材に固定化する工程と、光連結により基材に固定化された、標識部分を有する核酸類を、ハイブリッド形成した相補的二重鎖が解離する洗浄条件で洗浄することによって、光連結により基材に固定化されなかった、標識部分を有する核酸類を、除去する工程と、光連結により基材に固定化された、標識部分を有する核酸類を検出するために、標識部分を検出する工程と、を含む、核酸類混合物中に含まれる、特定の塩基配列を有する標的核酸類を検出(同定及び定量を含む)する方法。

【請求項27】ハイブリッド形成させる工程、及び光連結させて標識部分を有する核酸類を基材に固定化する工程が、20~30℃の温度で行われる、請求項26に記載の方法。

【請求項28】ハイブリッド形成させる工程、及び光連結させて標識部分を有する核酸類を基材に固定化する工程が、緩衝作用のある塩を含む反応溶液の中で行われる、請求項26又は請求項27に記載の方法。

【請求項29】反応溶液のpHが6.5~8.5の範囲にある、請求項28に記載の方法。

【請求項30】緩衝作用のある塩の濃度が、5~250mMの範囲にある、請求項28又は請求項29に記載の方法。

【請求項31】緩衝作用のある塩が、カコジル酸塩である、請求項28~30の何れかに記載の方法。

【請求項32】反応溶液が、水分散性有機溶媒を含む、請求項28~31の何れかに記載の方法。

【請求項33】反応溶液が、20~60%(体積比)の水分散性有機溶媒を含んでいる、請求項32に記載の方法。

【請求項34】水分散性有機溶媒が、アセトニトリルである、請求項32又は請求項33に記載の方法。

【請求項35】反応溶液が、アルカリ金属及び/又はアルカリ土類金属の塩を含み、該塩の濃度が、標的核酸類の濃度に対して最適化されている、請求項28~34の何れかに記載の方法。

【請求項36】アルカリ金属及び/又はアルカリ土類金属の塩として、塩化ナトリウム及び/又は塩化マグネシウムを含む、請求項35に記載の方法。

【請求項37】光照射が、330nm以上の波長の光の照射により行われる、請求項26~36の何れかに記載の方法。

【請求項38】洗浄条件が、80~100℃の範囲の洗浄温度での洗浄である、請求項26~37に記載の方法。

【請求項39】洗浄条件が、95~100℃の範囲の洗浄温度での洗浄である、請求項26~37に記載の方法。

【請求項40】洗浄条件が、変性剤を含む洗浄溶液での洗浄である、請求項26~39の何れかに記載の方法。

【請求項41】洗浄条件が、界面活性剤を含む洗浄溶液での洗浄である、請求項26~40の何れかに記載の方法。

【請求項42】標的核酸類が、オリゴヌクレオチドである請求項26~41の何れかに記載の方法。

【請求項43】標的核酸類が、DNAである請求項26~41の何れかに記載の方法。

【請求項44】標的核酸類が、RNAである請求項26~41の何れかに記載の方法。

【請求項45】標的核酸類が、ペプチド核酸である請求項26~41の何れかに記載の方法。

【請求項46】標識部分の標識が蛍光色素標識であり、標識部分の検出をする工程において、レーザースキャナを使用した蛍光測定を行う工程が含まれる、請求項26~45の何れかに記載の方法。

【請求項47】標識部分の標識がビオチン標識であり、標識部分の検出をする工程において、蛍光色素標識されたアビジンによって、ビオチン-アビジン結合反応を行う工程と、レーザースキャナを使用した蛍光測定を行う工程が含まれる、請求項26~46の何れかに記載の方法。

【請求項48】特定の塩基配列を有する標的核酸類の塩基配列と相補的な塩基配列から1塩基を置換した配列の核酸類が、光連結性核酸類と被光連結性核酸類とが光連結されることによって生成されるような塩基配列を有する、光連結性核酸類及び被光連結性核酸類を使用することによって、標的核酸類の塩基配列の点変異を検出する、請求項26~47の何れかに記載の方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • Japan Science And Technology Agency
  • Inventor
  • Fujimoto, Kenzo
  • Yoshimura, Yoshinaga
  • Ogasawara, Shinzi
IPC(International Patent Classification)
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