SYSTEM FOR INCREASING ACTIVITY OF SPECIFIC PROMOTER, AND VECTOR CARRYING THE SYSTEM

 本発明は腫瘍等の疾患の検出、治療に関する。本発明は特に特異的プロモーターの転写活性を特定の組織、細胞で特異的に上昇させ得るシステムを利用した疾患の検出、治療に関する。

 従来の遺伝子治療はレトロウイルスやアデノウイルス、ヘルペスウイルス(herpes simplex)を中心とする遺伝子治療用ベクターが使用されてきた。そして投与対象の組織及び癌特異的に遺伝子を発現させるために組織又は癌特異的プロモーターが用いられてきたが、プロモーター活性が低く十分な遺伝子発現及び治療効果が達成できない欠点があった。
 組織又は癌特異的遺伝子発現に関しては特異的プロモーターが使用されているが、その活性の弱さが大きな問題となっている。組織特異性を保ちつつプロモーター活性を上昇させる手段としてGAL4?VP16融合蛋白を用いたtwo step transcriptional system(TSTA)があり(特許文献1及び2並びに非特許文献1~3を参照)、近年その有用性がin vivo imagingや治療において検討されている。しかし、癌細胞に関してはアンドロゲン反応性をもつプロモーターを用いてアンドロゲン依存性前立腺癌(LNCap細胞)において検討しているのみであり、腫瘍全般に有効性のあるものではなく、その汎用性は低いと判断される。
 レトロウイルスによるヒトへのX?SCID遺伝子治療(幹細胞を用いたex vivo治療)では白血病を誘発し、アデノウイルスによるヒトへのオルニチントランスカルバミラーゼ(OTC)遺伝子治療では、アデノウイルスベクターを肝静脈に注入し肝細胞で遺伝子発現をさせるものであったが、重篤な肝不全を引き起こし死亡者が出るという問題があった。レトロウイルスに関しては遺伝子翻訳開始領域にDNA integrationを起してしまい、oncogene(LMO2)を活性化してしまうことが原因となり白血病が発症したと考えられている。アデノウイルスにおいては投与直後の非特異的免疫活性(IL?6やIL?8)及びウイルス蛋白(一部導入遺伝子蛋白)に対する細胞性・液性免疫の活性化が肝不全を引き起こしたことが報告されている。これらの方法を解決するためにはDNA integrationが少ない、そして免疫原性の弱いウイルスベクターを用いた遺伝子導入が望ましく、アデノ随伴ウイルス(adeno?associated virus;AAV)がそのようなウイルスベクターである。一方、腫瘍の局所内投与は対象患者に大きな侵襲を与えるものであり、非侵襲的な遺伝子ベクター投与法つまり血管内投与が可能でなくてはならない。そのためには血管内投与後、腫瘍のみに治療用ベクターが導入され且つ腫瘍細胞のみで遺伝子発現が起こるように感染向性・遺伝子発現が制御する必要があった。

【特許文献1】特表2005?502645号公報
【特許文献2】特表2007?535315号公報

【非特許文献1】Iyer M et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2001 Dec 4;98(25):14595?600
【非特許文献2】Iyer M et al.,Mol Ther.2004 Sep;10(3):545?52.
【非特許文献3】Ilagan R et al.,Cancer Res.2006 Nov 15;66(22):10778?85.

 組織や腫瘍特異的である特異的プロモーターの転写活性を上昇させ、標的遺伝子の特異的発現を増大させるシステムの提供並びに上記システムを保持した、診断又は治療用ウイルス製剤の提供を目的とする。
 本発明者は、上記の遺伝子治療に関わる問題点を克服すべく、新たなシステムの開発について鋭意検討を行った。本発明者は、プロモーターの活性を上昇させるシステムであるTSTAシステムにおいて、プロモーターとして組織や腫瘍に異的な特異的プロモーターを用い、さらに、転写活性化因子をコードするDNAとして、酵母の転写活性化因子であるGAL4のDNA結合ドメイン(GAL4 DBD)をコードするDNA、ポリグルタミン(Poly Q)若しくはポリプロリン(PolyP)をコードするDNAが挿入されたラットグルココルチコイドレセプター(Rat GR)をコードするDNA及びHSV1(単純ヘルペスウイルス)の転写制御因子であるVP16の転写活性化ドメインをコードするDNAがこの順で融合したDNAを用いたところ、特異的プロモーターの転写活性が飛躍的に高まり、標的遺伝子の発現量が増大することを見出し、改良型TSTAシステムの開発に成功した。
 さらに、上記の改良型TSTAシステムをアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターに組込み、アデノ随伴ウイルスの外殻に標的特異的ペプチドを挿入することにより、該標的特異的ペプチドと上記の改良型TSTAシステムの作用で、ウイルスベクターを特定の組織、細胞へデリバリーし感染させ、該細胞中で特異的にプロモーターの活性を上昇させ、診断又は治療用標的遺伝子の発現を増大させ得ることを見出した。標的特異的ペプチドとして腫瘍細胞特異的ペプチドを用い、特異的プロモーターとして腫瘍特異的プロモーターを用いた場合、AAVベクターは腫瘍のみに導入され、かつ腫瘍細胞のみで遺伝子発現が制御された。
 すなわち、本発明は以下のとおりである。
[1] 特異的プロモーターの下流にGAL4のDNA結合ドメインをコードするDNA、ポリグルタミン(Poly Q)若しくはポリプロリン(PolyP)をコードするDNAが挿入されたグルココルチコイドレセプター(GR)をコードするDNA及びVP16の転写活性化ドメインをコードするDNAがこの順で融合したDNAを連結した第1の発現カセットであって、GAL4のDNA結合ドメイン(GAL4 DBD)とポリグルタミン(Poly Q)若しくはポリプロリン(PolyP)が挿入されたグルココルチコイドレセプター(GR)と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子を発現し得る第1の発現カセット、並びに前記転写因子に応答性であり、GAL4結合部位を含む誘導性プロモーター(GAL4/TATA)の下流に標的遺伝子を連結した第2の発現カセットを含む、前記特異的プロモーターの転写活性を上昇させるためのシステム。
[2] 第1の発現カセットの下流に第2の発現カセットが1つのDNA構築物中に連結されている、[1]のシステム。
[3] 第1の発現カセットと第2の発現カセットを異なるDNA構築物として含む、[1]のシステム。
[4] 特異的プロモーターが、NkX2.5 プロモーター、GATA4プロモーター、MLC(myosin light chain)2v プロモーター、cardiac ankirin repeat プロモーター、ANF プロモーター、BNP(brain natriuretic factor)プロモーター、ANP(atrial natriuretic factor)プロモーター、synapsin 1プロモーター、tubulin α1プロモーター、SCG10 プロモーター、GFAP プロモーター、calcium/calmodulin?dependent protein kinase II プロモーター、neuron?specific enolase プロモーター、platelet?derived growth factor beta(PDGF?β)chainプロモーター、hTERTプロモーター、前立腺特異的抗原(PSA)プロモーター、癌胎児性抗原(CEA)プロモーター、α?フェトプロテイン(AFP)プロモーター、シクロオキシゲナーゼ?2(COX?2)プロモーター及びチロシナーゼプロモーターからなる群から選択される組織特異的又は腫瘍特異的プロモーターである、[1]~[3]のいずれかのシステム。
[5] 標的遺伝子がレポーター遺伝子又は疾患の治療に用い得る治療用遺伝子である、[1]~[4]のいずれかのシステム。
[6] 治療用遺伝子が腫瘍の治療に用い得る癌抑制遺伝子である[5]のシステム。
[7] 癌抑制遺伝子がREIC/Dkk?3遺伝子である、[6]のシステム。
[8] [1]~[7]のいずれかのシステムを保持したベクター。
[9] アデノ随伴ウイルスベクターである[8]のベクター。
[10] 外殻に標的細胞特異的結合ペプチドが挿入され、該標的細胞特異的結合ペプチドを発現する細胞に対する指向性を有する外殻改変ウイルスベクターである、[9]のアデノ随伴ウイルスベクター。
[11] 標的細胞特異的結合ペプチドがRGD、CDCRGDCFC(配列番号36)、NGR、CNGRCVSGCAGRC(配列番号37)、CLSSRLDAC(配列番号40)、CNSRLHLRC(配列番号41)、CENWWGDVC(配列番号42)、WRCVLREGPAGGCAWFNRHRL(配列番号43)、CLPVASC(配列番号44)、CGAREMC(配列番号45)、CKSTHDRLC(配列番号46)、CGNKRTRGC(配列番号47)、APRPG(配列番号48)、KQAGDV(配列番号49)、LDV、KRLDGS(配列番号50)及びDGEA(配列番号51)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、[10]のアデノ随伴ウイルスベクター。
[12] [7]~[11]のいずれかのベクターを含む疾患検出又は治療用製剤。
[13] 治療用遺伝子がREIC/Dkk?3遺伝子であり、標的細胞特異的結合ペプチドが、CDCRGDCFC(配列番号36)で現されるアミノ酸配列を有する、[12]の腫瘍治療用製剤。
[14] GAL4のDNA結合ドメインをコードするDNA、ポリグルタミン(Poly Q)若しくはポリプロリン(PolyP)をコードするDNAが挿入されたグルココルチコイドレセプター(GR)をコードするDNA及びVP16の転写活性化ドメインをコードするDNAがこの順で融合したDNAからなる転写因子をコードするDNA配列を含むDNA構築物。
[15] 配列番号22で表される配列からなるDNAを含む、[14]のDNA構築物。
[16] 特異的プロモーターの下流にGAL4のDNA結合ドメインをコードするDNA、ポリグルタミン(Poly Q)若しくはポリプロリン(PolyP)をコードするDNAが挿入されたグルココルチコイドレセプター(GR)をコードするDNA及びVP16の転写活性化ドメインをコードするDNAがこの順で融合したDNAを連結した第1の発現カセットであって、GAL4のDNA結合ドメイン(GAL4 DBD)とポリグルタミン(Poly Q)若しくはポリプロリン(PolyP)が挿入されたグルココルチコイドレセプター(GR)と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子を発現し得る第1の発現カセット、並びに前記転写因子に応答性であり、GAL4結合部位を含む誘導性プロモーター(GAL4/TATA)の下流に標的遺伝子を連結した第2の発現カセットを上記特異的プロモーターが活性である細胞に導入することにより、特異的プロモーターの活性をin vitroで上昇させる方法。
[17] 特異的プロモーターが、NkX2.5 プロモーター、GATA4プロモーター、MLC(myosin light chain)2v プロモーター、cardiac ankirin repeat プロモーター、ANF プロモーター、BNP(brain natriuretic factor)プロモーター、ANP(atrial natriuretic factor)プロモーター、synapsin 1プロモーター、tubulin α1プロモーター、SCG10 プロモーター、GFAP プロモーター、calcium/calmodulin?dependent protein kinase II プロモーター、neuron?specific enolaseプロモーター、platelet?derived growth factor beta(PDGF?β)chainプロモーター、hTERTプロモーター、前立腺特異的抗原(PSA)プロモーター、癌胎児性抗原(CEA)プロモーター、α?フェトプロテイン(AFP)プロモーター、シクロオキシゲナーゼ?2(COX?2)プロモーター及びチロシナーゼプロモーターからなる群から選択される組織特異的又は腫瘍特異的プロモーターである、[16]の方法。
[18] 標的遺伝子がレポーター遺伝子又は疾患の治療に用い得る治療用遺伝子である、[16]又は[17]の方法。
[19] 治療用遺伝子が腫瘍の治療に用い得る癌抑制遺伝子である[18]の方法。
 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2009?82358号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。

 図1は、本発明の改良型TSTAシステムの概要を示す図である。図1Aは従来のsingle step transcriptional amplification systemに用いる構築物の構造を、図1Bは従来のtwo step transcriptional amplification systemに用いる構築物の構造を、図1Cに本発明の改良型two step transcriptional amplification systemに用いる構築物の構造を示す。
 図2は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターの構造を示す図である。図2Aは特異的プロモーターとしてhTERTを含み特異的遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターに導入したDNA構築物である発現カセット(AdTSTA/RGD?AAV?Luc)の構造図を示し、図2Bが特異的プロモーターとしてhTERTを含み特異的遺伝子としてヒトREIC/Dkk?3遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターに導入したDNA構築物である発現カセット(AdTSTA/RGD?AAV?hREIC)の構造図を示す。図2Aの発現カセットの用途は全身の(微小)癌診断・モニター用ウイルス製剤であり、図2Bの発現カセットの用途は全身の(微小)癌治療用ウイルス製剤である。
 図3は、本発明の発現カセットであるDNA構築物及びアデノ随伴ウイルスベクターの製造工程を示す図である。
 図4は、本発明の発現カセットであるDNA構築物及びアデノ随伴ウイルスベクターの製造において用いたプライマー配列を示す図である。
 図5は、本発明の改良型TSTAシステムを用いときの癌細胞におけるプロモータ活性の上昇を示す図である。
 図6は、本発明の改良型TSTAシステムを用いたときの癌細胞における標的遺伝子の発現の上昇を示す図である。図6Aは各種癌細胞の結果を示し、図6BはLNCaP細胞のグラフを拡大したものを示す。
 図7は、アデノ随伴ウイルスの外殻への標的特異的ペプチドの挿入方法を示す図である。
 図8は、外殻へ標的特異的ペプチドを挿入したアデノ随伴ウイルスベクターの腫瘍細胞への導入効率を示す図である。図8AはHUVECの結果を、図8BはSKOV?3の結果を、図8CはK562の結果を示す。
 図9は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター(AdTSTA/RGD?AAV?Luc)を用いた、同所性肝臓癌モデルマウスにおける原発巣の検出の結果を示す図である。図9Aに検討のスケジュールの概要及びIVIS像を示し、図9Bに腫瘍塊の写真を示す。
 図10は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター(AdTSTA/RGD?AAV?REIC)を用いた、同所性肝臓癌モデルマウスにおける肝臓癌治療スケジュールを示す図である。
 図11は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター(AdTSTA/RGD?AAV?REIC)を用いた、同所性肝臓癌モデルマウスにおける肝臓癌治療効果を示す図である。図11AにAdTSTA/RGD?AAV?AFPを投与した群(コントロール群)におけるIVISシグナル及び組織Tunnelの結果(day30)を示し、図11BにAdTSTA/RGD?AAV?REICを投与した群におけるIVISシグナル及び組織Tunnelの結果(day30)を示す。
 図12は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター(AdTSTA/RGD?AAV?Luc)を用いた、腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の検出スケジュールを示す図である。
 図13は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター(AdTSTA/RGD?AAV?Luc)を用いた、腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の検出の結果を示す図である。図13Aにコントロール群におけるIVISシグナル及びマクロ病理の観察結果(day30)を示し、図13BにAdTSTA/RGD?AAV?Lucを投与した群におけるIVISシグナル及びマクロ病理の観察結果(day30)を示す。
 図14は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター(AdTSTA/RGD?AAV?REIC)を用いた、腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の治療スケジュールを示す図である。
 図15は、本発明のアデノ随伴ウイルスベクター(AdTSTA/RGD?AAV?REIC)を用いた、腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の治療効果を示す図である。図15AにAdTSTA/RGD?AAV?AFPを投与した群(コントロール群)におけるIVISシグナル及び組織Tunnelの結果(day30)を示し、図15BにAdTSTA/RGD?AAV?REICを投与した群におけるIVISシグナル及び組織Tunnelの結果(day30)を示す。
 図16は、本発明の改良型TSTAシステムを用いたときの各種癌細胞における標的遺伝子の発現の上昇を示す図である。

 以下、本発明を詳細に説明する。
 TSTA(Two?step transcriptional amplification)システムは、酵母のGAL4タンパク質のDNA結合ドメインであるGAL4?DBD(DNA binding dmain)と強力な転写活性を有するHSV由来のVP16タンパク質の転写活性化ドメインを応用した哺乳類細胞2ハイブリッドアッセイシステムを改良したものである。図1Bに概要を示す(図1においては、GAL4?DBDは、GAL4とのみ表示してある)。具体的には組織又は癌特異的プロモーターの下流に酵母GAL4とVP16を結合させた融合タンパク質遺伝子の下流にGAL4結合配列があり、そこにGAL4?VP16融合タンパク質が結合することにより活性化するTATA最小プロモーター(minimal promoter)が最終的に該プロモーター下流に存在する遺伝子を翻訳する。TSTAについては、Iyer M et al.,Proc Natl Acad Sci USA,2001 Dec 4,98(25),p.14595?600; Iyer M et al,Mol Ther,2004 Sep,10(3),p.545?52; Ilagan R et al,Cancer Res,2006 Nov 15,66(22),p.10778?85;特表2005?502645号公報;特表2007?53515号公報等に記載されている。
 本発明の改良型TSTA(advanced two?step transcriptional amplification)システムは、特異的プロモーターの下流に転写因子をコードするDNA配列が連結したDNA構築物を含む、転写因子を発現し得る第1の発現カセットとGAL4タンパク質結合部位の下流に最小プロモーターと標的遺伝子が連結したDNA構築物を含む第2の発現カセットを含む。第2の発現カセットは、第1の発現カセットにより発現した転写因子の作用で標的遺伝子を発現し得る。また、本発明は上記の第1の発現カセット及び第2の発現カセットを含むDNA構築物でもある。本発明のシステムにおいては、第1の発現カセットと第2の発現カセットは異なる別々のDNA構築物として含まれていてもよく、第1の発現カセットと第2の発現カセットが連結した1つのDNA構築物として含まれていてもよい。
 特異的プロモーターは選択的プロモーターともいい、現在までに知られている、あるいは今後報告され得るあらゆる特異的プロモーターが含まれる。例えば、組織若しくは器官特異的プロモーター、腫瘍特異的プロモーター、発生若しくは分化特異的プロモーター等が挙げられ、それぞれ特定の組織又は器官でプロモーター活性を有するプロモーター、細胞等の特定の発生段階でプロモーター活性を有するプロモーター、腫瘍細胞においてプロモーター活性を有するプロモーターである。この中でも組織若しくは器官特異的プロモーター及び腫瘍特異的プロモーターが好ましい。組織、器官特異的プロモーターとしてはNkX2.5、GATA4、MLC(myosin light chain)2v、cardiac ankirin repeat、ANF、BNP(brain natriuretic factor)、ANP(atrial natriuretic factor)などの心臓特異的プロモーターやSCG10、GFAPプロモーター、synapsin 1プロモーター、tubulin α1プロモーター、calcium/calmodulin?dependent protein kinase II プロモーター、neuron?specific enolaseプロモーター、PDGF(platelet?derived growth factor beta)?β chainプロモーター等の脳特異的プロモーターが挙げられる。また腫瘍特異的プロモーターとしては、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)のプロモーター、前立腺特異的抗原(PSA)プロモーター、癌胎児性抗原(CEA)プロモーター、α?フェトプロテイン(AFP)プロモーター、シクロオキシゲナーゼ?2(COX?2)プロモーター、チロシナーゼプロモーター等が挙げられる。プロモーターはプロモーター活性を有する最小配列からなるコアプロモーターの部分を用いればよい。コアプロモーターとは、正確な転写開始を導く働きをもつプロモーター領域をいい、TATAボックスを含むことがある。hTERTのコアプロモーターの配列を配列番号2に示す。通常、特異的プロモーターは転写活性が低く、特異的な標的遺伝子の発現量を増大させることは困難であったが、本発明の改良型TSTAシステムにより、現在までに知られている、あるいは今後報告され得るあらゆる特異的プロモーターの活性を増大させることができる。
 第1の発現カセットは、酵母の転写活性化因子であるGAL4のDNA結合ドメイン(GAL4 DBD)をコードするDNA、ポリグルタミン(Poly Q)若しくはポリプロリン(PolyP)をコードするDNAが挿入されたグルココルチコイドレセプター(GR)をコードするDNA及びHSV1(単純ヘルペスウイルス)の転写制御因子であるVP16の転写活性化ドメインをコードするDNAがこの順で融合したDNAを含む。従来のTSTAシステムにおいては、GAL4のDNA結合ドメインをコードするDNAとVP16の転写活性化ドメインをコードするDNAの融合DNAが用いられるが、本発明においては、これらのDNAの間にポリグルタミン(Poly Q)又はポリプロリン(PolyP)をコードするDNAが挿入されたグルココルチコイドレセプター(Rat GR)をコードするDNAが挿入される。グルココルチコイドレセプターの由来生物種は限定されないが、例えば、ラット由来のものが用いられる。グルココルチコイドレセプター中に挿入されるポリグルタミンのグルタミン残基又はポリプロリンのプロリン残基の数は10~80、好ましくは20~70、さらに好ましくは30~50、特に好ましくは40である。グルタミンはCAA又はCGAでコードされ、ポリグルタミンをコードするDNAは、CAAのみ又はCGAのみを含んでいてもよいし、両者を含んでいてもよい。また、プロリンはCCT、CCC、CCA又はCCGでコードされ、ポリプロリンをコードするDNAは、これらのトリプレットのうち、1種、2種、3種又は4種を含み得る。また、ポリグルタミン又はポリプロリンはグルココルチコイドレセプター中のどの部分に挿入されてもよい。例えば、グルココルチコイドレセプターのアミノ酸配列の4番目のTyrの後に挿入される。
 GAL4のDNA結合ドメインはGAL4タンパク質のアミノ酸1~147の断片であり、例えば、GAL4結合ドメインをコードするDNAの塩基配列は配列番号4に示される。また、例えばポリグルタミン(Poly Q)をコードするDNAが挿入されたグルココルチコイドレセプター(GR)をコードするDNAは配列番号5に示される。さらに、例えばVP16の転写活性化ドメインをコードするDNAは配列番号6に示される。
 第2の発現カセットは、GAL4応答エレメントであるGAL4結合部位(GAL4 binding domain)の下流に最小プロモーターと標的遺伝子が連結した構造を有する。GAL4結合部位(GAL4 binding domain)の下流に最小プロモーターが連結したものをGAL4結合部位を含む誘導性プロモーターともいい、GAL4/TATAで表される。GAL4結合部位は、5~20個、好ましくは5~10個、さらに好ましくは5個連結させる。GAL4結合ドメインの下流に位置するプロモーターは、第1の発現カセットにより発現される転写因子に応答性である誘導性プロモーターであり、GAL4反応性プロモーター、TATA最小プロモーター、アデノウイルスEIIb最小プロモーターを用いることができる。例えば、GAL4結合部位をコードするDNAの塩基配列は配列番号7に示され、最小プロモーターの塩基配列は配列番号8に示される。
 標的遺伝子は、本発明の改良型TSTAシステムにより最終的に発現させようとする標的遺伝子であり、癌などの疾患の診断に用い得るレポーター遺伝子又は癌などの疾患の治療に用い得る治療用遺伝子が挙げられる。
 第1の発現カセットであるDNA構築物及び第2の発現カセットであるDNA構築物において、プロモーター等は作動可能に連結され、さらに、エンハンサー、ターミネーター、ポリA配列等の制御配列を含んでいてもよい。
 レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ(LUC)遺伝子(配列番号10)、緑色蛍光タンパク質(Green fluorescent protein;GFP)等の蛍光タンパク質遺伝子、赤色蛍光タンパク質(DsRed)等の蛍光タンパク質遺伝子、βグルクロニダーゼ(GUS)遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子、β?ガラクトシダーゼ(LacZ)遺伝子等が挙げられる。また、ヘルペスウイルスサイミジンカイネース(HSV?tk)遺伝子等のPET(ポジトロン断層撮影)レポーター遺伝子を用いることもできる。特定の疾患の治療に用い得る治療用遺伝子としては、REIC/Dkk?3(配列番号21)、p53、Rb等の腫瘍抑制遺伝子、インターロイキン1(IL?1)、IL?2、IL?3、IL?4、IL?5、IL?6、IL?7、IL?8、IL?9、IL?10、IL?11、IL?12、IL?13、IL?14、IL?15、α?インターフェロン、β?インターフェロン、γ?インターフェロン、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、エンドスタチン、METH?1、METH?2、GM?CSF、G?CSF、M?CSF、腫瘍壊死因子等の生理活性物質をコードする遺伝子、RNA干渉作用を有するsiRNAやmiRNAをコードするDNA等が挙げられる。
 上記の第1の発現カセット及び第2の発現カセットを特定の組織の細胞や腫瘍細胞に導入することにより、特異プロモーターが作動し、GAL4のDNA結合ドメイン(GAL4 DBD)とポリグルタミン(Poly Q)又はポリプロリン(PolyP)が挿入されたグルココルチコイドレセプター(GR)と転写活性化ドメインの融合タンパク質である転写因子が発現する。該転写因子は第2の発現カセットのGLA4結合部位に結合し、GAL4応答性エレメントを含むプロモーターが作動し、下流に存在する標的遺伝子の発現が起こる。2段階の反応により、標的遺伝子の発現が増幅される。すなわち、改良形TSTAシステムが作用し、特異的プロモーターの転写活性が上昇し、該細胞内で目的遺伝子が高効率で発現される。この結果、標的遺伝子としてレポーター遺伝子を用いた場合、発光やPET(ポジトロン断層撮影)等により特定の標的組織や標的細胞を検出することができる。また、標的遺伝子をして治療用遺伝子を用いた場合、疾患に関連する癌細胞等の特定の細胞や組織で治療用遺伝子が発現し、治療効果を発揮する。第1の発現カセット及び第2の発現カセットは例えばベクターに挿入し、ベクターを介して細胞内に導入することができる。本発明において、第1の発現カセット及び第2の発現カセットを含むベクターを、第1の発現カセットと第2の発現カセットを含むシステムを保持したベクターという。ベクターとしては、プラスミド、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、センダイウイルスベクター等のウイルスベクターや生分解性ポリマーなどの非ウイルスベクターが挙げられる。上記発現カセットを導入したベクターを、感染等により細胞に導入すればよい。
 第1の発現カセット及び第2の発現カセットを連結し、1つのDNA構築物として製造することもできる。該DNA構築物は特異的プロモーター、GAL4のDNA結合ドメイン(GAL4 DBD)をコードするDNA、ポリグルタミン(Poly Q)若しくはポリプロリン(PolyP)をコードするDNAが挿入されたグルココルチコイドレセプター(GR)をコードするDNA及びHSV1(単純ヘルペスウイルス)の転写制御因子であるVP16の転写活性化ドメインをコードするDNAがこの順で融合したDNA、GAL4結合部位、最小プロモーター及び標的遺伝子が上流からこの順序で連結した構造を有する。この場合、第1の発現カセットと第2の発現カセットを含むDNA構築物を1つのベクターに導入する。
 本発明の第1の発現カセット及び第2の発現カセットを含むDNA構築物は、in vitroにおいて細胞を用いた実験に用いることも、非ヒト動物に導入して動物実験に用いることもでき、ヒトに導入して疾患の検出や治療に用いることもできる。
 なお、配列番号14に表される塩基配列において、配列番号14に表される塩基配列の1~3738番目の塩基からなる配列、すなわち配列番号1(配列番号14の1~6番目の塩基に相当)、配列番号2(hTERTコアプロモーター配列;配列番号14の7~461番目の塩基に相当)、配列番号3(配列番号14の462~467番目の塩基に相当)、配列番号4(GAL4 DNA結合ドメインをコードするDNA配列;配列番号14の468~911番目の塩基に相当)、配列番号5(ポリグルタミン(Poly Q)をコードするDNAが挿入されたラットグルココルチコイドレセプター(Rat GR)をコードするDNA配列;配列番号14の912~1163番目の塩基に相当)、配列番号6(VP16の転写活性化ドメインをコードするDNA配列;配列番号14の1164~1298番目の塩基に相当)、配列番号7(GAL4結合部位をコードするDNA配列;配列番号14の1299~1463番目の塩基に相当)、配列番号8(最小プロモーター配列;配列番号14の1464~1474番目の塩基に相当)、配列番号9(配列番号14の1475~1593番目の塩基に相当)、配列番号10(ルシフェラーゼをコードするDNA配列;配列番号14の1594~3246番目の塩基に相当)、配列番号11(配列番号14の3247~3259番目の塩基に相当)及び配列番号12(polyA配列;配列番号14の3260~3738番目の塩基に相当)を連結したものは、特異的プロモーターとしてhTERTを含み、レポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含む上記の改良型TSTAシステムの第1の発現カセットと第2の発現カセットを連結したDAN構築物の塩基配列に相当する。このうち、配列番号14に表される塩基配列の1~1298番目の塩基からなる配列が第1の発現カセットに含まれ、1299~3246番目の塩基からなる配列が第2の発現カセットに含まれる。
 また、配列番号20に表される塩基配列の1~3122番目の塩基からなる配列、すなわち配列番号1(配列番号20の1~6番目の塩基に相当)、配列番号2(hTERTコアプロモーター配列;配列番号20の7~461番目の塩基に相当)、配列番号3(配列番号20の462~467番目の塩基に相当)、配列番号4(GAL4 DNA結合ドメインをコードするDNA配列;配列番号20の468~911番目の塩基に相当)、配列番号5(ポリグルタミン(Poly Q)をコードするDNAが挿入されたラットグルココルチコイドレセプター(Rat GR)をコードするDNA配列;配列番号20の912~1163番目の塩基に相当)、配列番号6(VP16の転写活性化ドメインをコードするDNA配列;配列番号20の1164~1298番目の塩基に相当)、配列番号7(GAL4結合部位をコードするDNA配列;配列番号20の1299~1463番目の塩基に相当)、配列番号8(最小プロモーター配列;配列番号20の1464~1474番目の塩基に相当)、配列番号15(配列番号20の1475~1544番目の塩基に相当)、配列番号16(ヒトREIC/Dkk?3遺伝子DNA配列に6×HisをコードするDNA配列を付加した配列;配列番号20の1545~2621番目の塩基に相当)、配列番号17(配列番号20の2622~2643番目の塩基に相当)及び配列番号18(polyA配列;配列番号20の2644~3122番目の塩基に相当)を連結したものは、特異的プロモーターとしてhTERTを含み、レポーター遺伝子としてヒトREIC/Dkk?3遺伝子を含む上記の改良型TSTAシステムの第1の発現カセットと第2の発現カセットを連結したDAN構築物の塩基配列に相当する。このうち、配列番号20に表される塩基配列の1~1298番目の塩基からなる配列が第1の発現カセットに含まれ、1299~2621番目の塩基からなる配列が第2の発現カセットに含まれる。
 本発明は、さらに、GAL4のDNA結合ドメイン(GAL4 DBD)をコードするDNA、ポリグルタミン(Poly Q)若しくはポリプロリン(PolyP)をコードするDNAが挿入されたグルココルチコイドレセプター(GR)をコードするDNA及びHSV1(単純ヘルペスウイルス)の転写制御因子であるVP16の転写活性化ドメインをコードするDNAがこの順で融合した融合DNAであって、転写活性化因子をコードするDNA構築物を含む。該DNA構築物は例えば、配列番号22に表される塩基配列からなる。
 本発明の改良型TSTAシステムはあらゆる特異的プロモーターの転写活性を上昇させることができる。本発明は、改良型TSTAシステムを用いて特異的プロモーターの転写活性を上昇させる方法をも包含する。該方法においては、上記の第1の発現カセット及び第2の発現カセットを特異的プロモーターが活性である細胞に導入する。該細胞内で、特異的プロモーターが作動し、転写因子が発現し、転写因子がGAL4応答性エレメントに結合し、該エレメント下流に位置する標的遺伝子の発現が増幅され、特異的プロモーターの活性が上昇する。本発明の改良型TSTAシステムを利用することにより、特異的プロモーター活性は、従来型のTSTAシステムを利用した場合に対して、少なくとも5%以上、好ましくは10%以上、さらに好ましくは50%以上、さらに好ましくは2倍以上上昇する。プロモーター活性は後記の実施例に記載の方法で測定することができる。
 本発明は、さらに、上記改良型TSTAシステム用DNA構築物である第1の発現カセット及び第2の発現カセットを有するアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを含む。該ベクターは、癌等の疾患の特異的診断又は治療を可能とする。該ベクターはアデノ随伴ウイルスに上記の第1の発現カセットと第2の発現カセットを挿入して作製することができる。この際、第1の発現カセットと第2の発現カセットを連結したDNA構築物を挿入してもよい。また、2種類の別々のアデノ随伴ウイルスベクターに挿入してもよく、この場合は細胞に2種類のベクターを導入すればよい。
 アデノ随伴ウイルスは、パルボウイルス属1本鎖DNAウイルスであり、(1)遺伝子長期発現、(2)低毒性、(3)分裂及び非分裂細胞に遺伝子導入が可能という特性を有する。コンカタマー(concatamer;1本鎖DNAが連結した複合体)の形成が遺伝子長期発現の原因とされている。毒性に関してはアデノウイルスで知られるような肝毒性は少ない。
 本発明においては、アデノ随伴ウイルスベクターの外殻(カプシド)遺伝子に特定の細胞に特異的に発現するタンパク質に対する指向性を有し該細胞に結合する標的細胞特異的結合ペプチドをコードするDNAを挿入し、外殻を改変する。このようなペプチドを挿入することにより、該カプシド改変型アデノ随伴ウイルスベクターは特定のタンパク質を発現する特定の細胞を指向し該細胞に到達、結合し、感染し取り込まれ、細胞内で発現系が作用し、細胞内で標的遺伝子が発現し、診断や治療に用いることができる。アデノ随伴ウイルスの外殻遺伝子に挿入するDANがコードするペプチドは、腫瘍細胞や特定の組織若しくは器官の細胞に選択的に発現するタンパク質に結合することができ該細胞を指向する標的特異的ペプチドである。このようなペプチドとしては、例えば、腫瘍血管内皮細胞に対して指向性を有するペプチドが挙げられ、アミノ酸配列RGD又はNGRで表されるアミノ酸配列を含むペプチドが挙げられる。RGDを含むペプチドとしては、RGD配列を含みかつ細胞表面のインテグリンに対する結合親和性を有するペプチドが挙げられる。例えば、RGDを含めて5~20個のアミノ酸からなるペプチドである。このようなペプチドとして、例えば、4C?RGDペプチド(CDCRGDCFC:配列番号36)が挙げられる。ペプチドとして4C?RGDペプチドを用いた場合、該ペプチドはインテグリンと結合親和性を有するので、例えば、CHO細胞、気道上皮細胞、平滑筋細胞、血管内皮細胞、T細胞、マクロファージ、造血幹細胞、樹状細胞、インテグリンを細胞表面に有する癌細胞(例えばヒトグリオーマ細胞LN444)等も指向する。NGRを含むペプチドとしては、NGR配列を含みかつ細胞表面のアミノペプチダーゼN(CD13)に対する結合親和性を有するペプチドが挙げられる。例えば、NGRを含めて5~20個のアミノ酸からなるものが好ましく、具体的には、例えば、NGR関連ペプチド(CNGRCVSGCAGRC:配列番号37)を挙げることができる。ペプチドとしてNGR関連ペプチドを用いた場合、該ペプチドはアミノペプチダーゼN/CD13と結合親和性を有するので、例えば癌新生血管等のCD13発現細胞(例えばヒトグリオーマ細胞LN444)等も指向する。その他、臓器を指向するペプチドとして、脳を指向するCLSSRLDAC(配列番号40)、CNSRLHLRC(配列番号41)、CENWWGDVC(配列番号42)、WRCVLREGPAGGCAWFNRHRL(配列番号43)等、腎臓を指向するCLPVASC(配列番号44)、CGAREMC(配列番号45)等、(関節の)滑膜を指向するCKSTHDRLC(配列番号46)等、tumor lymphaticsを指向するCGNKRTRGC(配列番号47)等、血管新生している血管内皮細胞を指向するAPRPG(配列番号48)などの細胞の表面に存在するインテグリン(インテグリンは総称で、複数の種類がある)を指向するKQAGDV(配列番号49)、LDV、KRLDGS(配列番号50)、DGEA(配列番号51)等が挙げられる。これらのペプチドは、標的遺伝子を導入し、発現させようとする細胞に応じて適宜選択すればよい。これらのペプチドをコードする遺伝子を外殻遺伝子に挿入する場合、図7に示すように、配列番号38で表される外殻の586番目から594番目のアミノ酸配列で表される部分に、リンカーAS部及びALS部を介して配列番号39で表されるアミノ酸配列を挿入するようにすればよい。例えば、アデノ随伴ウイルスの外殻としてtype1を用いて、リンカーとして上記のAS部(制限酵素NheI)とALS部(制限酵素AflI)を用いて、該リンカーを介して標的特異的ペプチドを自由に変更できるようにすればよい。
 アデノ随伴ウイルスベクターは、公知の方法で製造することができる。例えば、米国特許第5,858,351号には、遺伝子治療に用い得る組換えアデノ随伴ウイルスの作製方法等が記載されている(Kotin(1994)Human Gene Therapy 5:793~801;Berns「Parvoviridae and their Replication」Fundamental Virology、第2版、Fields&Knipe編等)。
 図2に本発明の改良型TSTAシステムにより標的遺伝子を発現し得るアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターの模式図及び該ベクターに導入したDNA構築物である発現カセットの構造図を示す。図2Aが特異的プロモーターとしてhTERTを含み特異的遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターに導入したDNA構築物である発現カセットの構造図を示し、図2Bが特異的プロモーターとしてhTERTを含み特異的遺伝子としてヒトREIC/Dkk?3遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターに導入したDNA構築物である発現カセットの構造図を示す図である。これらのDNA構築物はITR(Inverted terminal repeat)で挟まれたアデノ随伴ウイルスの外殻に挿入する。
 配列番号14に図2Aに構造を示すルシフェラーゼ遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターの外殻中に含まれる塩基配列を示し、配列番号20に図2Bに構造を示すヒトREIC/Dkk?3遺伝子を含むアデノ随伴ウイルスベクターの外殻中に含まれる塩基配列を示す。配列番号14に表される塩基配列は、配列番号1(配列番号14の1~6番目の塩基に相当)、配列番号2(hTERTコアプロモーター配列;配列番号14の7~461番目の塩基に相当)、配列番号3(配列番号14の462~467番目の塩基に相当)、配列番号4(GAL4 DNA結合ドメインをコードするDNA配列;配列番号14の468~911番目の塩基に相当)、配列番号5(ポリグルタミン(Poly Q)をコードするDNAが挿入されたラットグルココルチコイドレセプター(Rat GR)をコードするDNA配列;配列番号14の912~1163番目の塩基に相当)、配列番号6(VP16の転写活性化ドメインをコードするDNA配列;配列番号14の1164~1298番目の塩基に相当)、配列番号7(GAL4結合部位をコードするDNA配列;配列番号14の1299~1463番目の塩基に相当)、配列番号8(最小プロモーター配列;配列番号14の1464~1474番目の塩基に相当)、配列番号9(配列番号14の1475~1593番目の塩基に相当)、配列番号10(ルシフェラーゼをコードするDNA配列;配列番号14の1594~3246番目の塩基に相当)、配列番号11(配列番号14の3247~3259番目の塩基に相当)、配列番号12(polyA配列;配列番号14の3260~3738番目の塩基に相当)及び配列番号13(配列番号14の3739~6664番目の塩基に相当)を連結したものに相当する。また、配列番号20に表される塩基配列は、配列番号1(配列番号20の1~6番目の塩基に相当)、配列番号2(hTERTコアプロモーター配列;配列番号20の7~461番目の塩基に相当)、配列番号3(配列番号20の462~467番目の塩基に相当)、配列番号4(GAL4 DNA結合ドメインをコードするDNA配列;配列番号20の468~911番目の塩基に相当)、配列番号5(ポリグルタミン(Poly Q)をコードするDNAが挿入されたラットグルココルチコイドレセプター(Rat GR)をコードするDNA配列;配列番号20の912~1163番目の塩基に相当)、配列番号6(VP16の転写活性化ドメインをコードするDNA配列;配列番号20の1164~1298番目の塩基に相当)、配列番号7(GAL4結合部位をコードするDNA配列;配列番号20の1299~1463番目の塩基に相当)、配列番号8(最小プロモーター配列;配列番号20の1464~1474番目の塩基に相当)、配列番号15(配列番号20の1475~1544番目の塩基に相当)、配列番号16(ヒトREIC/Dkk?3遺伝子DNA配列に6×HisをコードするDNA配列を付加した配列;配列番号20の1545~2621番目の塩基に相当)、配列番号17(配列番号20の2622~2643番目の塩基に相当)、配列番号18(polyA配列;配列番号20の2644~3122番目の塩基に相当)及び配列番号19(配列番号20の3123~6048番目の塩基に相当)を連結したものに相当する。
 本発明において上記配列番号の塩基配列で表されるDNAは、それぞれのDNAが有する活性又はそれぞれのDNAがコードするタンパク質若しくはポリペプチドが有する活性を有している限り、塩基配列に変異を有していてもよい。例えば、それぞれの配列番号で表される塩基配列に相補的な塩基配列を有するDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、それぞれの配列番号で表される塩基配列と、BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information(米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール))等(例えば、デフォルトすなわち初期設定のパラメータを用いて)を用いて計算したときに、少なくとも85%以上、好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上、特に好ましくは97%以上の相同性を有しているDNA、又は前記DNAによりコードされるタンパク質若しくはポリペプチドのアミノ酸配列に対して1又は複数若しくは数個(1~10個、好ましくは1~5個、さらに好ましくは1個若しくは2個)のアミノ酸が置換、欠失及び/又は付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質若しくはポリペプチドをコードするDNAも本発明のDNA構築物の構築に用いることができる。ここで、「ストリンジェントな条件」とは、例えば、「1XSSC、0.1% SDS、37℃」程度の条件であり、より厳しい条件としては「0.5XSSC、0.1% SDS、42℃」程度の条件であり、さらに厳しい条件としては「0.2XSSC、0.1% SDS、65℃」程度の条件である。このようにハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほどプローブ配列と高い相同性を有するDNAを単離を期待し得る。ただし、上記のSSC、SDS及び温度の条件の組み合わせは例示であり、プローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーションの反応時間などを適宜組み合わせることにより、必要なストリンジェンシーを実現することが可能である。
 これらのアデノ随伴ウイルスベクターにおいて、指向する細胞に合わせて特異的プロモーター配列を変更することができ、この場合、配列番号14又は配列番号20のh?TERTコアプロモーター配列を別のプロモーター配列に置換すればよい。また、診断に用いるレポーター遺伝子や治療に用いる遺伝子も適宜変更することができ、この場合、配列番号14又は配列番号20の遺伝子を別の遺伝子に置換すればよい。
 本発明の改良型TSTAシステムにより標的遺伝子を発現し得るアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターは、疾患検出又は疾患治療に用い得る。疾患としては、癌等が挙げられ、アデノ随伴ウイルスベクターの外殻に挿入された特定の細胞に発現しているタンパク質に選択的に結合するRGD等のペプチドにより該細胞を指向し、該細胞に感染し、細胞内で改良型TSTAシステムが作用し、標的遺伝子が発現する。標的遺伝子がルシフェラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子の場合、特定の細胞を発光等により検出することができる。特定の細胞が癌細胞の場合、被験体に投与することにより、被験体中の癌細胞を検出し、該被験体が癌に罹患していることを診断することができる。本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは細胞1個を検出することができるので、例えば微小癌の検出に用いることができる。
 また、標的遺伝子が治療用遺伝子の場合、特定の細胞中で標的遺伝子が発現し、治療効果を発揮し得る。例えば、特定の細胞が癌細胞であり、REIC/Dkk?3遺伝子等の癌抑制遺伝子を用いた場合、被験体に投与することにより、被験体の癌細胞に癌治療用遺伝子がデリバリーされ、癌細胞中で遺伝子が発現し、治療効果を発揮する。本発明は、このようなアデノ随伴ウイルスベクターを含む診断又は治療用ウイルス製剤を包含する。治療用遺伝子として、ヒトREIC/Dkk?3遺伝子等の癌抑制遺伝子を用いた場合の治療対象となる癌としては、本発明の治療対象となる癌としては、例えば、脳・神経腫瘍、皮膚癌、胃癌、肺癌、肝癌、リンパ腫・白血病、結腸癌、膵癌、肛門・直腸癌、食道癌、子宮癌、乳癌、副腎癌、腎癌、腎盂尿管癌、膀胱癌、前立腺癌、尿道癌、陰茎癌、精巣癌、骨・骨肉腫、平滑筋腫、横紋筋腫、中皮腫等が挙げられる。本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは原発性癌の治療にも転移性癌の治療にも用いることができる。
 本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、遺伝子治療の分野において使用可能な方法、例えば、静脈内投与や動脈内投与などの血管内投与、経口投与、腹腔内投与、気管内投与、気管支内投与、皮下投与、経皮投与等により投与することができる。特に、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは特定の組織、細胞への指向性が大きく、標的遺伝子を効率的に特定の組織、細胞へデリバリーすることができるので、血管内投与によっても、効率的に診断、治療を行うことができる。
 アデノ随伴ウイルスベクターは、治療上有効量を投与すればよい。治療上の有効量は、遺伝子治療分野の当業者であれば容易に決定することができる。さらに、投与量は、被験者の病態の重篤度、性別、年齢、体重、習慣等によって適宜変更することができる。例えば、アデノ随伴ウイルススベクターを、0.5×10¹¹~2.0×10¹²viral genome/kg体重、好ましくは1.0×10¹¹~1.0×10¹²viral genome/kg体重、さらに好ましくは1.0×10¹¹~5.0×10¹¹viral genome/kg体重の量で投与すればよい。viral genomeは、アデノ随伴ウイルスのゲノムの分子数(ウイルス粒子数)を表し、particleということもある。製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤、賦形剤を含む。たとえば、錠剤用の担体、賦形剤としては、乳糖、ステアリン酸マグネシウムなどが使用される。注射用の水性液としては、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液などが使用され、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、プロピレングリコールなどのポリアルコール、非イオン界面活性剤などと併用しても良い。油性液としては、ゴマ油、大豆油などが使用され、溶解補助剤としては安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどを併用してもよい。
 本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。

 改良型TSTA(two?step transcriptional amplification)システムの創出
(1) 改良型TSTA(two?step transcriptional amplification)システムの創出
 TSTAシステムは、酵母のGAL4タンパク質のDNA結合ドメインであるGAL4?DBD(DNA binding dmain)(図1においては、GAL4とのみ表示)と強力な転写活性を有するHSV由来のVP16タンパク質の転写活性化ドメインを応用した哺乳類細胞2ハイブリッドアッセイシステムを改良したものである。具体的には組織又は癌特異的プロモーターの下流に酵母GAL4とVP16を結合させた融合タンパク質遺伝子の下流にGAL4結合配列があり、そこにGAL4?VP16融合タンパク質が結合することにより活性化するTATA最小プロモーター(minimal promoter)が最終的に該プロモーター下流に存在する遺伝子を翻訳する。TSTAについては、Iyer M et al.,Proc Natl Acad Sci USA,2001 Dec 4,98(25),p.14595?600; Iyer M et al,Mol Ther,2004 Sep,10(3),p.545?52; Ilagan R et al,Cancer Res,2006 Nov 15,66(22),p.10778?85;特表2005?502645号公報;特表2007?53515号公報等に記載されている。
 本実施例では、GAL4?VP16融合遺伝子間に40個のグルタミンをグルココルチコイドレセプター(ラット)の間に挟みこんだもの(GR moiety with polyQと表示)を挿入した。TSTAにおいて、GAL4?VP16融合遺伝子間に40個のグルタミンをグルココルチコイドレセプター(ラット)の間に挟みこんだもの(GR moiety with polyQと表示)を挿入するシステムを改良型TSTAシステムという。図1に従来のsingle step transcriptional amplification system(図1A)、従来のtwo step transcriptional amplification system(図1B)及び本発明の改良型two step transcriptional amplification system(図1C)に用いる構築物の構造を示す。図1Cに示すように、改良型TSTAシステムにおいては、組織又は癌特異的プロモーターの下流にGAL4のDNA結合ドメインをコードするDNAとHSV1(単純ヘルペスウイルス)の転写制御因子であるVP16の転写活性化ドメインをコードするDNAの融合DNAであって、両DNAの間にラットのグルココルチコイドレセプターをコードするDNAの間に40個のグルタミンをコードするDNAを挟んだDNAが挿入されたDNAが存在し、さらにその下流に5個のGAL4結合ドメインをコードするDNAが存在し、さらにその下流にアデノウイルスの最小プロモーターが存在し、さらにその下流にレポーター遺伝子が存在する。
 本実施例においては、プロモーターとして腫瘍細胞特異的に活性をもつヒトテロメアーゼのプロモーターであるhTERTプロモーターを用いた。
 上記の改良型TSTAシステム用DNA構築物を含むアデノ随伴ウイルスベクターを作製し用いた。発現させる遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子(配列番号10)又は癌抑制遺伝子であるヒトREIC/Dkk?3遺伝子(配列番号21)を用いた。
 改良型TSTAシステム用DNA構築物を含むアデノ随伴ウイルスベクターは図3に示す工程により作製した。図4に図3の工程で用いたプライマーの配列を示す。

 各種癌細胞を用いての検討
 プロモーターとして、hTERTプロモーターを含みレポーター遺伝子としてルシフェラーゼ遺伝子を含む、改良型TSTAシステム用DNA構築物を含むpGL3 basicベクター(Promega社)を各種癌細胞(PC3、Hep3B、HepG2、LNCaP、HeLa)及び正常細胞(OUMS、PrEC)に感染させた。
(1)hTERT活性
 Tel TAGGGテロメラーゼPCR ERISA^PLUS(Roche社)によりhTERT活性を直接測定した。
 図5に、相対的hTRET活性(各種癌細胞におけるhTERT活性)を測定した結果を示す。PC3(前立腺癌)を1.0としたときの値をbar graphで示す。正常細胞(OUMS:線維芽細胞、PeEC:前立腺細胞)では著しく低いが、各種癌細胞では著しくhTERT活性が高かった。
(2)ルシフェラーゼ発現
 各癌細胞における、ルシフェラーゼの発現を公知のルミノメーターによるアッセイ法により測定した。この際、TSTAシステムを利用せずに、hTERTプロモーターのみによるルシフェラーゼ活性(single step(hTERTのみ))、hTERTプロモーターを用いた従来のTSTAシステムによるルシフェラーゼ活性(two step(hTERT+TSTA))及びhTERTプロモーターを用いた本発明の改良型TSTAシステムによるルシフェラーゼ活性(two step+polyQ(hTERT+adTSTA))によるルシフェラーゼ活性を測定した。
 図6Aに、結果を示す。各細胞においてhTERTのみのルシフェラーゼ活性を1.0とした。図6BはLNCCaPの結果を示す。hTERT+TSTAはある種の癌細胞(LNCapやHeLa)ではhTERTプロモーターより転写活性が低くなることがあったが、改良型TSTA=hTERT+adTSTAでは全ての癌細胞でhTERTプロモーターのみの場合より転写活性が高くなった。正常細胞では、転写活性はほぼ変化が無かった。

 RGDを外殻に含むアデノウイルス随伴ベクターの腫瘍細胞への感染効率の検討
 αv integrin(腫瘍血管に多く発現)のリガンドとなるRGD(Arg?Gly?Asp)ペプチド7をAAV外殻に挿入し、その腫瘍特異的集積を検討した。アデノ随伴ウイルスベクターはhTERTプロモーターを含む改良型TSTAシステム用DNA構築物を含むものを用いた。また、レポーター遺伝子としては、GFP(Green Fluorescent Protein)を用いた。この際、コントロールとしてRGDを挿入しないものを用いた。RGDを挿入したアデノ随伴ウイルスベクターをadTSTA/RGD?AAV?GFP(AAV1?RGD)とし、RGDを挿入しないアデノ随伴ウイルスベクターをadTSTA?AAV?GFP(AAV1)とする。RGDは4C?RGD(CDCRGDCFC:配列番号36)を用い、リンカーとしてAS及びALSを用いた(図7)。
 5×10⁵個のRGDのリガンドであるαv integrinが強発現している細胞(HUVEC、SKOV?3及びK562)を24wellプレートに播き24時間後に20MOIのadTSTA?AAV?GFP(AAV1)又はadTSTA/RGD?AAV?GFP(AAV1?RGD)に感染させ、72時間後にGFP陽性細胞率を判定した。
 結果を図8に示す。図8A、B及びCはそれぞれ、HUVEC、SKOV?3及びK562の結果を示す。3種類の細胞でadTSTA?RGD?AAV?GFPによる有意な感染効率の上昇が認められ、それらは培養液中に添加されたRGD?peptide(RGDS,Sigma:200g/ml)で中和された。
 これらはadTSTA?RGD?AAV?GFPによる感染効率の上昇がRGD?αv integrin結合に由来することを示しており、ウイルス表面のRGDが確実に機能していることを強く示唆している。

 同所性肝臓癌モデルマウスにおける原発巣の診断
 同所性肝臓癌モデルマウスを用いて、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターを用いた原発性癌モニターに関する検討を行った。
 アデノ随伴ウイルスベクターはhTERTプロモーターを含む改良型TSTAシステム用DNA構築物を含み外殻にRGDを挿入したものを用いた。また、レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼを用いた。該アデノ随伴ウイルスベクターをadAdTSTA/RGD?AAV?Lucという。
 500万個のヒト肝臓癌細胞Hep3BをBalbcヌードマウスの肝臓に移植し(day0)、その5日後に1010 particleのadAdTSTA/RGD?AAV?Lucを尾静脈より投与した(day5)。その後定期的(day8、day20及びday30)に、IVIS SPECTRUM(XENOGEN社)(in vivo imaging system)にて観察した。
 図9Aに検討のスケジュールの概要及びIVIS像を示す。
 day8で剣状突起周囲に一点のIVISシグナルを認めた。そのシグナルは徐々に増大し、day30にはIVIS上で認めたシグナルに一致して肝臓表面に15×5mm大の腫瘍塊を認めた。
 これらは、adTSTA/RGD?AAV?Lucが植込み直後のHep3B(微小癌と考えられる)に取り込まれルシフェラーゼ(Luc)遺伝子を発現し、その後Lucを発現しているHep3B細胞が増殖、腫瘍塊を形成したと考えられる。図9Bに腫瘍塊の写真を示す。本実施例は、adTSTA/RGD?AAV?Lucが微小癌のモニターに用いることができることを示している。
 本実施例で用いたモデルマウスはあくまでも原発性微小癌の一例であり、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、腫瘍組織に効率的に取り込まれ、且つ腫瘍細胞でしか遺伝子を発現しない特性を有することから、あらゆる原発性微小癌の診断及びモニターに有用である。

 同所性肝臓癌モデルマウスにおける肝臓癌治療効果の検討
 実施例4で用いた遺伝子をルシフェラーゼ遺伝子からヒトREIC/Dkk?3遺伝子(癌抑制遺伝子)に変更し、アデノ随伴ウイルスベクターの治療効果を検討した。アデノ随伴ウイルスベクターをAdTSTA/RGD?AAV?REICという。
 肝臓に植え込む細胞としては、ルシフェラーゼ遺伝子を恒常発現しているHep3B/Luc細胞を使用した。この場合、IVISシグナルはHep3B/Lucの細胞数に比例する。
 細胞移植5日後に1010 particleのAdTSTA/RGD?AAV?REICを尾静脈より投与した。コントロール群ではヒトREIC/Dkk?3遺伝子の代わりにAFP(αフェトプロテイン)遺伝子を含むAdTSTA/RGD?AAV?ALPを投与した。
 図10に治療スケジュールを示す。また、図11BにAdTSTA/RGD?AAV?REICを投与した群におけるIVISシグナル及び組織Tunnelの結果(day30)を示す。また、図11AにAdTSTA/RGD?AAV?AFPを投与した群(コントロール群)におけるIVISシグナル及び組織Tunnelの結果(day30)を示す。図より明らかな通り、REIC治療群ではday30でシグナルがほぼ消失しているが、コントロール群ではシグナルが明らかに増大していた。
 組織Tunnel(アポトーシス検知)より、アポトーシスが治療効果の大きな原因と考えられた。本実施例により、adTSTA/RGD?AAV?REICが同所性肝臓癌に対して治療効果があることが証明された。
 本実施例で用いたモデルマウスはあくまでも原発性微小癌の一例であり、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、腫瘍組織に効率的に取り込まれ且つ腫瘍細胞でしか遺伝子を発現しない特性を有すること、またREIC遺伝子の持つ広範な腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果から、あらゆる原発性癌の治療に有用であると考えられる。

 腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の診断
 腎臓癌RENCA細胞肺転移モデルマウスを使用し、血行性肺転移モデルにおける、診断・治療効果の検討を行った。用いたアデノ随伴ウイルスベクターは実施例4で用いたものと同じであった。
 5万個のRENCA細胞をBalbcヌードマウスの尾静脈から血行性に肺に移植した(day0)。
その5日後に1010 particleのAdTSTA/RGD?AAV?Lucを尾静脈より投与した(day5)。コントロール群ではPBSを投与した。その後定期的(day8、day20、day30)にIVISにて観察した。
 実験スケジュールを図12に示す。また、図13BにAdTSTA/RGD?AAV?Lucを投与した群におけるIVISシグナル及びマクロ病理の観察結果(day30)を示す。また、図13Aにコントロール群におけるIVISシグナル及びマクロ病理の観察結果(day30)を示す。
 30日目におけるIVIS画像より明らかなように、AdTSTA/RGD?AAV?Lu投与群において明らかに肺転移巣に一致したシグナルを認めた。
 この結果は、AdTSTA/RGD?AAV?Lucが血行性肺転移のモニターに用いることができることを示す。
 本実施例で用いたモデルマウスはあくまでも腎臓癌血行性肺転移の一例であり、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、腫瘍組織に効率的に取り込まれ、且つ腫瘍細胞でしか遺伝子を発現しない特性を有することから、あらゆる血行性転移癌のモニターに有用であると考えられる。

 腎臓癌血行性肺転移モデルマウスにおける転移巣の治療効果の検討
 実施例5で用いたAdTSTA/RGD?AAV?REICを用い、治療効果の検討を行った。血行性に肺に植え込む細胞としては、ルシフェラーゼ遺伝子を恒常発現しているRENCA/Luc細胞を使用した。この場合、IVISシグナルはRENCA/Lucの細胞数に比例する。
 細胞移植5日後に1010 particleのAdTSTA/RGD?AAV?REICを尾静脈より投与した。コントロール群ではAdTSTA/RGD?AAV?ALPを投与した。
 図14に治療スケジュールを示す。また、図15BにAdTSTA/RGD?AAV?REICを投与した群におけるIVISシグナル及び組織Tunnelの結果(day30)を示す。また、図15AにAdTSTA/RGD?AAV?AFPを投与した群(コントロール群)におけるIVISシグナル及び組織Tunnelの結果(day30)を示す。
 図より明らかな通り、REIC治療群ではday30でシグナルがほぼ消失しているが、コントロール群ではシグナルが明らかに増大していた。
 組織Tunnel(アポトーシス検知)より、アポトーシスが治療効果の大きな原因と考えられた。本実施例は、AdTSTA/RGD?AAV?REICが腎臓癌血行性肺転移に対して治療効果があることを示す。
 本実施例で用いたモデルマウスはあくまでも血行性転移癌の一例であり、本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、腫瘍組織に効率的に取り込まれ且つ腫瘍細胞でしか遺伝子を発現しない特性を有すること、またREIC遺伝子の持つ広範な腫瘍細胞に対する抗腫瘍効果から、あらゆる血行性転移癌の治療に有用であると考えられる。

 実施例2と同様に、各種癌細胞を用いて検討を行った。用いた癌細胞は、NCCIT(精巣腫瘍細胞)、MDA231(乳癌細胞)、A549(肺癌細胞)、H28(悪性中皮腫細胞)、KPK1(腎臓癌細胞)、211H(悪性中皮腫細胞)、J82(膀胱癌細胞)及びA431(類表皮癌細胞)であった。図16に結果を示す。各細胞においてhTERTのみのルシフェラーゼ活性を1.0とした。hTERT+TSTAはある種の癌細胞(A549、H28、211H、J82、A431)ではhTERTプロモーターより転写活性が低くなることがあったが、改良型TSTA=hTERT+adTSTAでは全ての癌細胞でhTERTプロモーターのみの場合より転写活性が高くなった。本実施例の結果は、実施例2の結果を併せて、本発明のシステムが癌細胞全般において有用であることを示す。

 実施例に示すように、本発明の改良型TSTAシステムは、従来のTSTAシステムに比べ飛躍的に特異的プロモーター活性を上昇させ、特定の組織や細胞での所定の標的遺伝子の発現を増大させる。標的遺伝子として、疾患の検出や治療に用い得る遺伝子を用いることにより、優れた検出、治療システムとして利用することができる。また、上記改良型TSTAシステムを組込み外殻に標的特異的ペプチドを挿入したアデノ随伴ウイルスベクターは特定の組織、細胞を強く指向し、該組織、細胞に到達し、該組織細胞中での特異的プロモーターの活性が上昇し、所定の標的遺伝子の発現を増大させる。本発明のアデノ随伴ウイルスベクターは、疾患の検出用又は治療用ウイルス製剤として用いることができる。
 従来のTSTAシステムを用いたプラスミドでの癌治療の検討や癌治療例は散見されるがウイルスベクターでの成功例は少なく(lentivirus,HSV,adenovirusなどで若干例)、アデノ随伴ウイルスでの成功例は世界発である。

配列番号1~20及び22~51 合成
 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。