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NON-HUMAN MAMMAL MODEL OF EPILEPSY

Foreign code F110002649
File No. S2008-0323-C0
Posted date Apr 6, 2011
Country WIPO
International application number 2009JP052230
International publication number WO 2009101939
Date of international filing Feb 10, 2009
Date of international publication Aug 20, 2009
Priority data
  • P2008-031002 (Feb 12, 2008) JP
Title NON-HUMAN MAMMAL MODEL OF EPILEPSY
Abstract Provided is a genuine model animal of epilepsy, since most of the existing model animals are so-called seizure model animals showing forcibly-induced seizure. Also provided is a method whereby a recombinant can be easily distinguished. A non-human mammal model of epilepsy which is an epilepsy model of a non-human animal such as rat having the same genetic defect as human genetic defect causing epilepsy, which carries a genetic mutation that is the genetic defect having been transferred into the non-human mammal DNA of neuron nicotinic acetylcholine receptor α4 subunit (CHRNA4) gene or β2 subunit (CHRNB2) gene relating to human autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy and which also carries a mutated gene obtained by transferring a specific probe thereinto. A recombinant of this non-human mammal model of epilepsy can be easily distinguished.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Epilepsy, about 2% people suffering from Japan is also relatively more neurological disease is, the molecular biology was unknown for a longer period. This is due to the many epilepsy is a general term for a wide variety of diseases. However, recently, little by little familial epilepsy center has been found that genetic abnormality.
Of which is an autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy, one of the 1 familial epilepsy, epileptic seizures according to an aspect of the night, its causative gene as well as abnormal receptor subunit β 2 α 4 gene wherein the mutation of CHRNA 4 and CHRNB 2 have been reported (non-patent document 1). Include a failure of the CHRNA 4 gene, S284L, 3 as well as the type of 291-292insL S280F have been reported (non-patent document 2, 3, 4, 5). Include a failure of the CHRNB 2 gene, V287L, 3 and V287M of the I312M types of a genetic abnormality that has been reported (non-patent document 6, 7, 8).
The development of epilepsy as well as diagnostic methods and the processing method as a means for the development of a so-called 'epilepsy model animal' is used. Conventional epilepsy model animal, convulsions or seizure-inducing material such as electrical stimulation using 'convulsions model animal' in. In addition, by introducing a sugar chain antibody genes cause epilepsy-like spasms of the transgenic non-human mammal is disclosed (patent document 1). In addition, ankylosing spondylitis posture conversion in response to a symptom of epilepsy or a convulsive disorder, gene function μ3B were deleted on the chromosome are also generated non-human animal (patent document 2). However, these conventional model animal, animal models of stroke and in reducing convulsions but, animal models of human molecular biology and in reducing the true epilepsy did not.
The inventors of this invention, dominant nocturnal frontal lobe epilepsy neuron human chromosome nicotinic acetylcholine receptor subunit gene α 4 284 (CHRNA 4) of the first Ser is substituted to Leu is found in (non-patent document 9).
Therefore, the inventors of the present invention, gene mutations of the CHRNA 4 receptor gene recombinant gene was introduced at a gene recombinant epilepsy model animals ate (patent document 3).
However, in the prior art, to produce a recombinant animal models of such genes in a full-size, the probability of homologous recombination to occur not high, a large number of recombinants was screened. Also, screening recombinant sequencing a portion of that gene is necessary, therefore much time and expense have been expended. Therefore, without recombinant gene sequencing method for determining if developed, can be a significant time and expense would be saved from, in the method of determining the development of such a recombinant body has been also needed.
Hirose, S., et al., Neurology 53:1749-1753, 1999
Steinlein, O.K., et al. A missense mutation in the neuronal nicotinic acetylcholine receptor alpha 4 subunit is associated with autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy. Nat Genet 11, 201-203 (1995).
Hirose, S., et al. A novel mutation of CHRNA4 responsible for autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy. Neurology 53, 1749-1753 (1999).
Steinlein, O.K., et al. Independent occurrence of the CHRNA4 Ser248Phe mutation in a Norwegian family with nocturnal frontal lobe epilepsy. Epilepsia 41, 529-535 (2000).
Steinlein, O.K., et al. An insertion mutation of the CHRNA4 gene in a family with autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy. Hum Mol Genet 6, 943-947 (1997).
De Fusco, M., et al. The nicotinic receptor b2 subunit is mutant in nocturnal frontal lobe epilepsy. Nat Genet 26, 275-276 (2000).
Phillips, H.A., et al. CHRNB2 is the second acetylcholine receptor subunit associated with autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy. Am J Hum Genet 68, 225-231 (2001).
Bertrand, D., et al. The CHRNB2 mutation I312M is associated with epilepsy and distinct memory deficits. Neurobiol Dis 20, 799-804 (2005).
Hirose, S., et al. A novel mutation of CHRNA4 responsible for autosomal dominant nocturnal frontal lobe epilepsy. Neurology 53, 1749-1753 (1999).
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲 [1]
ヒトのてんかん遺伝子異常と同じ遺伝子異常を有するてんかんモデル非ヒト哺乳動物であって、該てんかんモデル非ヒト哺乳動物が、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連するニューロンアセチルコリン受容体遺伝子のα4サブユニットCHRNA4またはβ2サブユニットCHRNB2の非ヒト哺乳動物のChrna4またはChrnb2に遺伝子変異が変異導入されているとともに、元来の塩基配列とは異なる塩基配列を有するが、アミノ酸配列が同一になる塩基配列を有するプローブが導入された変異遺伝子を有することを特徴とするてんかんモデル非ヒト哺乳動物。

[2]
請求項1に記載のてんかんモデル非ヒト哺乳動物において、前記変異遺伝子が前記変異導入により新たな制限酵素切断部位が出現していることを特徴とするてんかんモデル非ヒト哺乳動物。

[3]
請求項1または2に記載のてんかんモデル非ヒト哺乳動物において、前記 Chrna4 が、変異導入によってその cDNA の845番のC(シトシン) をT(チミン) (c.845 C>T ) および846番のG(グアニン)) をC(シトシン) (c.846G>C) に変異導入した配列番号9で表される塩基配列を有することを特徴とするてんかんモデル非ヒト哺乳動物。

[4]
請求項1、2または3に記載のてんかんモデル非ヒト哺乳動物において、前記変異導入によって前記 Chrna4 の cDNA にc.845T>C および/または c.846G>A の変異導入して、前記α4サブユニットCHRNA4の p.282 番と相同のアミノ酸残基 Ser が Phe に置換されていることを特徴とするてんかんモデル非ヒト哺乳動物。

[5]
請求項1または2に記載のてんかんモデル非ヒト哺乳動物において、前記 Chrna4 が、変異導入によってそのcDNA の856番の T(チミン)を C(シトシン)(c.856T>C) および/または857番のC(シトシン)をT(チミン) (c.857C>T) に変異導入した配列番号12で表される塩基配列を有することを特徴とするてんかんモデル非ヒト哺乳動物。

[6]
請求項1、2または5に記載のてんかんモデル非ヒト哺乳動物において、前記変異導入によって非ヒト動物のChrna4にc.856T>Cおよびc.857C>Tを変異導入して、前記α4サブユニットCHRNA4のp.286番と相同のアミノ酸残基SerがLeuに置換されていることを特徴とするてんかんモデル非ヒト哺乳動物。

[7]
請求項1または2に記載のてんかんモデル非ヒト哺乳動物において、前記遺伝子が、変異導入によってそのChrna4にc.878-879insGCTまたはc.879-880insTTAが変異導入された配列番号15または16でそれぞれ表されることを特徴とするてんかんモデル非ヒト哺乳動物。

[8]
請求項1、2または7に記載のてんかんモデル非ヒト哺乳動物において、前記変異導入によって前記Chrna4にc.878-879insGCTまたはc.879-880insTTAが変異導入されて、前記α4サブユニットCHRNA4のp.293番と相同のアミノ酸残基Leuとp.294番と相同のアミノ酸残基Ileの間にLeuが挿入されていることを特徴とするてんかんモデル非ヒト哺乳動物。

[9]
請求項1または2に記載のてんかんモデル非ヒト哺乳動物において、前記 Chrnb2 が、変異導入によってその cDNAの856番のG(グアニン) が C(シトシン)(c.856G>C)または A(アデニン)(c.856G>A)に変異導入した配列番号19または22でそれぞれ表される塩基配列を有することを特徴とするてんかんモデル非ヒト哺乳動物。

[10]
請求項1、2または9に記載のてんかんモデル非ヒト哺乳動物において、前記変異導入によって前記Chrnb2にc.856G>Cまたはc.856G>Aが変異導入されて、前記β2サブユニットCHRNB2のp.286番と相同のアミノ酸残基Valがそれぞれ、LeuまたはMetに置換されていることを特徴とするてんかんモデル非ヒト哺乳動物。

[11]
請求項1ないし10のいずれか1項に記載のてんかんモデル非ヒト哺乳動物において、前記特定のプローブが配列番号23または24で表される塩基配列からなることを特徴とするてんかんモデル非ヒト哺乳動物。

[12]
請求項1ないし11のいずれか1項に記載のてんかんモデル非ヒト哺乳動物の作出方法であって、ヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連するニューロンアセチルコリン受容体遺伝子のα4サブユニットCHRNA4またはβ2サブユニットCHRNB2の遺伝子異常に関連する遺伝子変異を非ヒト動物のChrna4またはChrnb2 のcDNAに変異導入し、かつ、前記cDNAの塩基配列の1部を、その配列部分とはアミノ配列が同一になるが、塩基配列が異なるプローブで置換して変異遺伝子を作成し、該変異遺伝子を発現ベクターに移行し、該発現ベクターに含まれる該変異遺伝子を受精卵を受胚雌動物に移植することによって組換え非ヒト動物を作出することを特徴とするてんかんモデル非ヒト哺乳動物の作出方法。

[13]
請求項12に記載のとするてんかんモデル非ヒト哺乳動物の作出方法において、前記変異遺伝子に前記変異導入により新たな制限酵素切断部位を出現させることを特徴とするてんかんモデル非ヒト哺乳動物の作出方法。

[14]
請求項12または13に記載のてんかんモデル非ヒト哺乳動物の作出方法において、前記変異導入によってChrna4のcDNAの845番のC(シトシン)をT(チミン) (c.845 C>T) ならびに/もしくは846番のG(グアニン)をC(シトシン)(c.846G>C) または856番のT(チミン)をC(シトシン)(c.856T>C) ならびに857番のC(シトシン)をT(チミン)(c.857C>T) に置換または878番と879番との間にコドンGCT (c.879-880insGCT) もしくは879番と880番との間にコドンTTA (c.879-880insTTA) を挿入して変異導入することを特徴とするてんかんモデル非ヒト哺乳動物の作出方法。

[15]
請求項12、13または14に記載のてんかんモデル非ヒト哺乳動物の作出方法において、前記Chrna4のcDNAに c.845 C>T ならびにc.846G>C または c.856T>C ならびにc.857C>T または c.878-879insGCT もしくはc.879-880insTTAをそれぞれ変異導入することによって、前記α4サブユニットCHRNA4と相同のアミノ酸残基p.282番のSerをPheまたはアミノ酸残基p.284番のSerをLeuに置換することまたはアミノ酸残基p.293番のLeuとp.294番のIleの間にLeuを挿入して変異導入することを特徴とするてんかんモデル非ヒト哺乳動物の作出方法。

[16]
請求項12または13に記載のてんかんモデル非ヒト哺乳動物の作出方法において、前記変異導入によってChrnb2のcDNAの856番のG(グアニン)をC(シトシン) (c.856G>C) または A(アデニン)(c.856G>A) に置換することを特徴とするてんかんモデル非ヒト哺乳動物の作出方法。

[17]
請求項12、13または16に記載のてんかんモデル非ヒト哺乳動物の作出方法において、前記Chrnb2にc.856G>Cまたはc.856G>Aを導入することによって、前記β2サブユニットCHRNB2と相同のアミノ酸残基p.286番のValをLeuまたはMetにそれぞれ置換することを特徴とするてんかんモデル非ヒト哺乳動物の作出方法。

[18]
遺伝子の塩基配列に1個または複数個の変異導入がされ、かつ、該遺伝子の塩基配列の1部が、該塩基配列の1部とは、塩基配列は異なるが、同一のアミノ酸配列になるプローブで置換されていることを特徴とする変異遺伝子。

[19]
請求項18に記載の変異遺伝子において、前記変異導入により出現した新規制限酵素切断部位を有していることを特徴とする変異遺伝子。

[20]
請求項18または19に記載の変異遺伝子において、前記遺伝子がヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連するニューロンアセチルコリン受容体遺伝子のα4サブユニットCHRNA4またはβ2サブユニットCHRNB2にそれぞれ相同する非ヒト哺乳動物の相同遺伝子Chrna4 またはChrnb2であることを特徴とする変異遺伝子。

[21]
請求項18、19または20に記載の変異遺伝子において、前記Chrna4のcDNAの845番のC(シトシン)がT(チミン) (c.845 C>T) ならびには846番のG(グアニン)がC(シトシン)(c.846G>C)、または856番のT(チミン)がC(シトシン)(c.856T>C) ならびに857番のC(シトシン)がT(チミン)(c.857C>T)、または878番と879番との間にコドンGCT (c.878-879insGCT) もしくは879番と880 番との間にコドンTTA (879-880insTTA) が変異導入されていることを特徴とする変異遺伝子。

[22]
請求項18ないし21のいずれか1項に記載の変異遺伝子において、前記Chrna4 の cDNAに c.845 C>T ならびにc.846G>C または c.856T>C ならびにc.857C>Tまたは c.879-880insGCT をそれぞれ変異導入することによって、前記α4サブユニットCHRNA4と相同のアミノ酸残基p.280番のSerをPheまたはアミノ酸残基p.284番のSerがLeuに置換されていること、またはc.878-879insGCTもしくはc.879-880insTTAを挿入して変異導入することによって前記α4サブユニットCHRNA4と相同のアミノ酸残基p.293番のLeuとp.294番のIleの間にLeuが挿入されていることを特徴とする変異遺伝子。

[23]
請求項18または19に記載の変異遺伝子において、前記Chrnb2のcDNAの856番のG(グアニン)をC(シトシン) (c.856G>C) または A(アデニン)(c.856G>A) に変異導入されていることを特徴とする変異遺伝子。

[24]
請求項18、19または23に記載の変異遺伝子において、前記Chrnb2にc.856G>Cまたはc.856G>Aを導入することによって、前記β2サブユニットCHRNB2と相同のアミノ酸残基p.286番のValがLeuまたはMetにそれぞれ変異導入されていることを特徴とする変異遺伝子。

[25]
請求項18ないし25のいずれか1項に記載の変異遺伝子を、該遺伝子の塩基配列に1個または複数個の変異を導入し、かつ、該塩基配列の1部を、該遺伝子の1部の塩基配列とは塩基配列が異なるが、同一のアミノ酸配列になるプローブで置換して挿入することを特徴とする変異遺伝子の作成方法。

[26]
請求項25に記載の変異遺伝子の作成方法において、前記変異導入により新規制限酵素切断部位を出現させることを特徴とする変異遺伝子の作成方法。

[27]
請求項25または26に記載の変異遺伝子の作成方法において、前記遺伝子がヒト常染色体優性夜間前頭葉てんかんに関連するニューロンアセチルコリン受容体遺伝子のα4サブユニットCHRNA4またはβ2サブユニットCHRNB2にそれぞれ相同する非ヒト哺乳動物の相同遺伝子Chrna4 またはChrnb2であることを特徴とする変異遺伝子の作成方法。

[28]
請求項25、26または27に記載の変異遺伝子の作成方法において、前記Chrna4 の cDNAに c.845C>T ならびにc.846G>C または c.856T>C ならびにc.857C>Tまたは c.878-879insGCT もしくはc.879-880insTTAをそれぞれ変異導入することを特徴とする変異遺伝子の作成方法。

[29]
請求項25ないし28のいずれか1項に記載の変異遺伝子の作成方法において、前記Chrna4のcDNAにc.845C>T ならびにc.846G>C または c.856T>C ならびには c.857C>T または c.879-880insGCT をそれぞれ導入することによって、前記α4サブユニットCHRNA4と相同のアミノ酸残基p.282番のSerをPheまたはアミノ酸残基p.284番のSerをLeuに置換することまたはアミノ酸残基p.293番のLeuとp.294番のIleの間にLeuを変異導入することすることを特徴とする変異遺伝子の作成方法。

[30]
請求項25または26に記載の変異遺伝子の作成方法において、前記Chrnb2のcDNAにc.856G>Cまたはc.856G>Aを変異導入することを特徴とする変異遺伝子の作成方法。

[31]
請求項25、26または30に記載の変異遺伝子の作成方法において、前記Chrnb2にc.856G>Cまたはc.856G>Aを導入することによって、前記β2サブユニットCHRNB2と相同のアミノ酸残基p.286番のValがLeuまたはMetにそれぞれ変異導入されていることを特徴とする変異遺伝子の作成方法。

[32]
請求項1ないし11に記載のてんかんモデル非ヒト哺乳動物の相同組換え体を識別する識別方法であって、ヒトニューロンアセチルコリン受容体のα4サブユニットCHRNA4またはβ2サブユニットCHRNB2にそれぞれ相同する非ヒト哺乳動物の相同遺伝子Chrna4 またはChrnb2の塩基配列の1部と、その塩基配列は異なるが、アミノ酸配列が同一になるプローブの制限酵素を用いて、該相同組換え体に該プローブが、請求項18ないし24のいずれか1項に記載の変異遺伝子に導入されているかどうかを検出することによって該てんかんモデル非ヒト哺乳動物の相同組換え体を識別することを特徴とする識別方法。

[33]
請求項32に記載の識別方法において、前記変異遺伝子に制限酵素切断部位が出現している場合には、該制限酵素切断部位の制限酵素を用いて該てんかんモデル非ヒト哺乳動物の相同組換え体を識別することを特徴とする識別方法。

  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • Fukuoka University
  • Hirosaki University
  • Inventor
  • HIROSE, Shinichi
  • KANEKO, Sunao
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IS KE KG KM KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LT LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RS RU SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM
EPO: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

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