MANUFACTURING METHOD FOR THEAFLAVINS, USING RAW TEA LEAVES

関連する出願
 本出願は,日本特許出願2008-87500(2008年3月28日出願)に基づく優先権を主張しており,この内容は本明細書に参照として取り込まれる。

技術分野
 本発明は、テアフラビン類の製造方法に関する。

 紅茶の赤色色素であるテアフラビン類は、紅茶中に約1%含まれており、主としてテアフラビン(TF) 、テアフラビン3-O-ガレート(TF3-G)、テアフラビン3’-O-ガレート(TF3’-G)、テアフラビン3,3’-ジ-O-ガレート(TFDG)の4種類がある。

 テアフラビン類には、抗菌作用、抗酸化作用、血糖降下作用、抗腫瘍活性、血小板凝集抑制作用、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌に対する効果など、さまざまな生理作用のあることが知られており、天然着色料としてだけではなく、生理活性物質としても有用であると考えられる。

 テアフラビンの合成法としては、これまでに、フェリシアン化カリウムを用いる方法(非特許文献1)、酵素試料(やぶきた若葉の水不溶画分)を用いる方法(非特許文献2)、茶葉から得たポリフェノールオキシダーゼを用いる方法(非特許文献3)、各種果実ホモジネート体を用いる方法(非特許文献4)、緑茶抽出液とポリフェノール酸化酵素を含有する植物抽出液とを用いる方法(特許文献1)、西洋ワサビペルオキシダーゼを用いる方法(非特許文献5)、加工緑茶葉とポリフェノールオキシダーゼとを接触させる方法(特許文献2)、緑茶のスラリーをタンナーゼで処理し、アルゴン又は窒素雰囲気下発酵させる方法(特許文献3)、生葉の搾汁を発酵させることにより得る方法(非特許文献6)などが報告されている。しかし、いずれの方法もテアフラビン類の収率が低い。また、エピカテキンとエピガロカテキンを原料とし、ペルオキシダーゼを含有する植物培養細胞と過酸化水素を用いる方法(特許文献4)や、加工茶葉の水溶液に茶培養細胞と過酸化水素を添加する方法(特許文献5)もあるが、高価な原料や酵素を使用する必要があった。

 本明細書において引用される参考文献は以下のとおりである。これらの文献に記載される内容はすべて本明細書に参照として取り込まれる。

【特許文献1】特開2002-95415
【特許文献2】特表2005-523242
【特許文献3】特開平11-225672
【特許文献4】特開2007-143461
【特許文献5】特願2007-182217(未公開)
【非特許文献1】Yoshinori Takino, Hiroshi Imagawa, Agr. Biol. Chem., 27, 319-321 (1963)
【非特許文献2】滝野慶則、今川弘、 農化、37,417-422 (1963)
【非特許文献3】Alastair Robertson, Derek S.Bendall., Phytochemistry, 22, 883-887 (1983)
【非特許文献4】Takashi Tanaka, Yayoi Betsumiya, Chie Mine, Isao kouno, Chem. Commun., 2000, 1365-1366
【非特許文献5】Shengmin Sang., Bioorganic & Medicinal Chemistry 12, 459-467(2004)
【非特許文献6】J. Food. ENG., 82, 276-283 (2007)

 本発明は、テアフラビン類を安価かつ簡単に製造する方法を提供することを目的とする。

 本発明者は、萎凋処理前の生茶葉に大量の水を加えミキサーで破砕後、静置または振とうまたは撹拌することにより、茶生葉中の4種類のカテキン類を効率よくテアフラビン類に変換しうることを見いだした。すなわち、本発明は、テアフラビン類の製造方法であって、生茶葉に水および/または緑茶葉抽出液を加えて破砕し、静置または振とうまたは撹拌により培養した後に培養物からテアフラビン類を回収することを特徴とする方法を提供する。

 本発明の1つの態様においては、水および/または緑茶葉抽出液を加えて破砕した生茶葉を24時間から120時間静置する。このことにより、カテキン類を効率よくテアフラビン類に変換させるとともに、テアフラビン3-O-ガレート、テアフラビン3’-O-ガレート、テアフラビン3,3’-ジ-O-ガレートと比較して、テアフラビンを高収率で得ることができる。

 本発明の別の態様においては、水および/または緑茶葉抽出液を加えて破砕した生茶葉を10分間から1時間振とうする。このことにより、カテキン類を効率よくテアフラビン類に変換させるとともに、テアフラビン、テアフラビン3-O-ガレート、テアフラビン3’-O-ガレート、テアフラビン3,3’-ジ-O-ガレートの4種類の混合物を得ることができる。

 本発明の別の態様においては、水および/または緑茶葉抽出液を加えて破砕した生茶葉を10分間から8時間スターラーにて撹拌する。このことにより、カテキン類を効率よくテアフラビン類に変換させるとともに、テアフラビン、テアフラビン3-O-ガレート、テアフラビン3’-O-ガレート、テアフラビン3,3’-ジ-O-ガレートの4種類の混合物を高収率で得ることができる。撹拌のスピードをコントロールする事によりテアフラビンを選択的に得るか、または4種類のテアフラビンの混合物を得るか選択する事が可能である。

 好ましくは、生成したテアフラビン類は、有機溶媒による抽出、クロマト分離、反応混合物からカフェインと没食子酸を昇華させること、または反応水溶液の温度を適宜に変える事により分別再結晶させることにより回収する。より好ましくは、反応水溶液中のカフェインをクロロホルムで抽出したのち、テアフラビン類を酢酸エチルなどの有機溶媒で抽出する。別の態様では、テアフラビン類はカフェインと没食子酸とともに回収される。

 本発明の方法によれば、極めて安価かつ簡単な方法により、テアフラビン類を効率よく製造することができる。また、培養条件を調節することにより、テアフラビンを選択的に製造するか、4種類のテアフラビン類を製造するかを選択することができる。

テアフラビン類
 テアフラビン類には、主に下記に示す4種類がある。
【化学式1】

 紅茶葉のテアフラビン類の含有比率は、テアフラビン(TF) 0.08%、テアフラビン3-O-ガレート(TF3-G) 0.3%、テアフラビン3’-O-ガレート(TF3’-G) 0.2%、テアフラビン3,3’-ジ-O-ガレート(TFDG)0.4%である。

テアフラビンの生合成経路
 テアフラビンの生合成経路は下記のとおりである(Takashi Tanaka, Chie Mine, KyokoInoue, Miyuki Matsuda and Isao Kouno, J. Agric. Food Chem. 2002, 50, 2141-2148)。
【化学式2】

 まず、EC(エピカテキン)が、茶葉中のポリフェノールオキシダーゼまたはペルオキシダーゼにより速やかに酸化されてEC-キノンとなり、つづいてEC-キノンはEGC(エピガロカテキン)を酸化して、EGC-キノンを生成させる。これらの酸化過程で得られたEGC-キノンのEC-キノンへのマイケル付加、つづくカルボニル付加により3員環中間体を生成し、つづいて酸化、脱炭酸を経てトロポノイド骨格を形成し、テアフラビンが生成される。

 茶葉中には主として4種類のカテキン[EC,EGC,ECG(エピカテキンガレート)、EGCG(エピガロカテキンガレート)]が存在し、紅茶の製茶工程、いわゆる発酵工程では、上記と同様の経路にて、以下のカテキンの組み合わせにより、4種類のテアフラビン類(TF,TF3-G,TF3’-G,TFDG)が生成される。
【化学式3】

 紅茶葉中の4種類のテアフラビン類の割合は、原料となるカテキンの含量により左右される。紅茶葉中のテアフラビン(TF)の割合が全テアフラビン中8%と低いのはエピカテキンの含量が他のカテキンに比べ低いためである。4種類のテアフラビン類の中でテアフラビン(TF)は紅茶の紅色が鮮やかであるため、TFの含量が高い程、高価な紅茶葉である。

原料
 本発明の方法において使用する生茶葉とは、収穫後、萎凋処理をする前の茶葉をいい、好ましくは茶葉を破砕処理せずに用いる。茶葉とは茶の葉及び茎であり別々に使っても良いし、あわせて使用してもよい。原料となる生茶葉としては、一般に栽培されている緑茶品種および紅茶品種のいずれの茶葉も用いることができる。生茶葉は、採取直後に冷凍して使用しても良い。茶葉の採取時期は、1番茶、2番茶、3番茶、4番茶のいずれでも良い。ただし、それぞれの葉ごとにカテキン量、ポリフェノールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、タンナーゼ、加水分解酵素の活性が異なるため、高収率を得るために反応条件を適宜調節することが好ましい。価格、カテキン量、酵素活性等を総合的に判定すると、本発明の方法において用いる茶葉としては2番茶および3番茶が望ましい。

茶葉の品種の違い
 日本で栽培されている代表的な茶葉としては、あさつゆ、やぶきた、やまとみどり、まきのはらわせ、かなやみどり、おくみどり、おおいわせ、おくひかり、めいりょく、さみどり、こまかげ、やまなみ、みねかおり、はつもみじ、紅富貴、紅ほまれ、べにひかり等があり、本発明の方法では世界中で栽培されている茶葉のいずれをも好適に用いることができる。例えば、やぶきた茶は緑茶品種、紅富貴および紅ほまれは紅茶品種である。これらの茶葉に含まれる主なカテキン類は以下のとおりである。
やぶきた茶:EGCG, ECG, EGC, EC
紅富貴:EGCG, ECG, EGC, EC, エピガロカテキン3-(3”-O-メチル)ガレート (EGC3”methyl), エピガロカテキン3-(4”-O-メチル)ガレート (EGC4”methyl), エピカテキン3-(3”-O-メチル)ガレート (EC3”methyl),
紅ほまれ:EGCG, ECG, EGC, EC, EGC3”methyl, EGC4”methyl, EC3”methyl

 紅富貴および紅ほまれには、やぶきた茶には含まれていないEGC3”methyl, EGC4”methyl, EC3”methyl が存在する。これらの成分は花粉症に有効とされる抗アレルギー物質である。紅富貴及び紅ほまれは紅茶品種であるため、従来の紅茶製法で製茶した場合、EGC3”methyl, EGC4”methyl, EC3”methyl の成分は消失してしまう。

1番茶から4番茶等、茶葉の収穫時期による相違
 やぶきた1番茶、2番茶及び3番茶を用いた場合、葉を摘み取った後または冷凍庫で冷凍した後、すぐミキサーで破砕し、静置または振とう、または撹拌することができる。しかしやぶきた4番茶の場合、同様の方法ではテアフラビン類の生成量は低かった。これは、4番茶は1番茶、2番茶及び3番茶に比べポリフェノールオキシダーゼやペルオキシダーゼの酵素活性が低いため、あるいはカテキン量が低いためであると考えられる。また。そこで葉を摘みとったのち、2日から5日間程、室温下放置後、同様の操作を行うことが望ましい。またカテキン量が低く、テアフラビン類の生成量が低い場合、2日から5日間程、室温下放置後、葉に水と番茶抽出液(番茶に水を加え抽出した液)を加え同様の操作を行うことが望ましい。

テアフラビン類の製造法
 本発明の方法においては、萎凋処理前の生茶葉に水を加え、ミキサー等を用いて生茶葉を破砕した後、分離せずに静置または振とうまたは撹拌する。生茶葉に水を加えて破砕すると、茶葉の細胞中に存在するポリフェノールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、タンナーゼ、加水分解酵素、さらに各種茶の成分カテキン類、カフェイン等の成分が水中へ侵出される。これらの酵素及び成分が侵出された液を静置または振とうまたは撹拌すると、これらの酵素の作用により、カテキン類の全てがテアフラビン類に変換されると共に没食子酸が生成される。ペルオキシダーゼは過酸化水素存在下、テアフラビンを生成させる酵素である。この場合、過酸化水素は代謝により生成されるので、外から添加しなくてもよい。一方、ポリフェノールオキシダーゼは、酸素存在下、テアフラビン類を生成させる酵素である。タンナーゼは、カテキン類およびテアフラビン類のガレート基を切断することができる。また、ガレート基は加水分解酵素の作用によっても切断される。

静置法
 本発明の1つの態様においては、生茶葉に水を加えて破砕した後、固液を分離せずに所定時間静置する。採取直後のやぶきた茶の二番茶の生葉に水を加えミキサーにて1分破砕した後、24時間静置したところ、TF,TF3G,TF3’GおよびTFDGが生成した(実施例1)。120時間静置すると全てのカテキン類がテアフラビン(TF)に変換した(実施例2)。一方、ミキサーにて破砕した後に振とうすると、他のテアフラビン類の生成率が高くなった(実施例7)。

 本発明では、生茶葉に水を加え破砕すると、ポリフェノールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、加水分解酵素、さらに各種茶の成分カテキン類、カフェイン等の成分が水中へ侵出される。これらの酵素及び成分が侵出された液を静置させた場合、振とう法に比べ酸素の供給が断たれるため、テアフラビン生成に関わるポリフェノールオキシダーゼとペルオキシダーゼのうち、ポリフェノールオキシダーゼの作用が低い(ポリフェノールオキシダーゼは酸素存在下酸化反応を触媒するため、静置法では水中の溶存酸素が消費されれば働けない)。このため、24時間静置では、TF3G, TF3’G,TFDGは生成するが、振とう法に比べ他のテアフラビン類の生成率は抑えられたと考えられる(実施例1と7の比較)。一方120時間放置すると、酸素供給が絶たれているためペルオキシダーゼが主として作用するとともに、加水分解酵素が働き、24時間の反応で得られたTF3G, TF3’G, TFDGの加水分解反応が進行し、全てTFに変換する(実施例1と2の比較)。さらにこの時、次のような反応も進行すると考えられる。まず、ECとEGCよりペルオキシダーゼの酵素反応によりTFが生成する。一方、TFに関与しないECG及びEGCGは、タンナーゼあるいは加水分解酵素によりガレート基が切断され、EC及びEGCに変換された後、ペルオキシダーゼによりTFへと変換される。加水分解反応は平衡反応であるが、加水分解により得られたEC及びEGCはペルオキシダーゼによりテアフラビンに変換するため、EC及びEGCの消費に伴い平衡反応は右に傾き、ECG及びEGCGの加水分解反応は完全に進行して、120時間後では4種類のカテキンが全てテアフラビン(TF)に変換した。

【化学式4】

 静置時間は、使用する茶葉の種類、含有水分、保存状態等によって異なるが、好ましくは12時間以上、より好ましくは24時間以上、さらにより好ましくは120時間以上である。静置時間の上限は特になく、テアフラビン類の生成をモニターしながら、適当な時期に反応を終了させることができる。静置温度は、酵素が作用しうる温度範囲内であれば特に制限はなく、例えば10℃から40℃、好ましくは20℃から30℃である。

振とう法
 本発明の別の態様においては、生茶葉に水を加えて破砕した後、固液を分離せずに所定時間振とうする。萎凋処理前の生茶葉に大量の水を加えミキサーで1分から5分間破砕後、10分から1時間振とうすると、茶生葉中の4種類のカテキン類が全て4種類のテアフラビン類に変換する。振とうすることにより、ポリフェノールオキシダーゼとペルオキシダーゼが共に作用するため、テアフラビン、テアフラビン3-O-ガレート、テアフラビン3’-O-ガレート、テアフラビン3,3’-ジ-O-ガレートの4種類の混合物を得ることができる。

 振とう時間は、使用する茶葉の種類、含有水分、保存状態等によって異なるが、好ましくは3分間から2時間、より好ましくは10分間から1時間である。カテキン類がテアフラビン類に変換した後にさらに振とうを続けると、テアフラビン類がポリマー化していくため、収量の低下が顕著である。最適な振とう時間は用いる茶葉により異なり、当業者は容易に条件を最適化することができる。振とう温度は、酵素が作用しうる温度範囲内であれば特に制限はなく、例えば10℃から40℃、好ましくは20℃から30℃である。

撹拌法
 本発明の別の態様においては、生茶葉に水を加えて破砕した後、固液を分離せずに所定時間撹拌を行う。撹拌は、ミキサー、スターラー、回転板、ボトルローラーなどを用いて空気が液体中に巻き込まれないような速度で運転することにより行うことができる。萎凋処理前の生茶葉に大量の水を加えミキサーで1分から5分間破砕後、10分から8時間撹拌すると、茶生葉中の4種類のカテキン類が全て4種類のテアフラビン類に変換する。空気の巻き込みに注意して非常にゆっくり撹拌すると全てのカテキン類がテアフラビン(TF)に変換した(実施例10)。撹拌速度をあげると空気の巻き込みがおこるため他のテアフラビン類の生成率が高くなった(実施例11)。撹拌法は静置法に比べ反応の時間を非常に短くすることができるという利点を有する。

茶葉の破砕条件
 破砕は0℃から30℃の温度で行うことができる。ミキサーによる破砕時間を3分にすると、1分に比べ、テアフラビン類の含量が大幅に増えた。その後静置し、24時間と120時間でテアフラビン類の含量を測定したところ、120時間後では24時間後に比べTF3G, TF3’G, TFDGの含量は減ったが、実施例2のように完全にTFに変換できなかった。この理由として、3分の振とうではTF3G,TF3’G,TFDGの含量が増えたため、120時間の加水分解では完全に加水分解反応が進行しなかったと思われる。この場合さらに長時間静置する必要がある。もしくはEGCG及びECGは加水分解されやすく、TF3G, TF3’G及びTFDGは加水分解されにくいため、120時間の加水分解では3分の振とうにより増大したTF3G, TF3’G及びTFDG の加水分解を完全に進行させることが出来なかったと考えられる(実施例2と4と5の比較)。なお、ここでいうミキサーとは容量約700~1000ml、出力200~300W程度の家庭用のミキサー(ブレンダー)であり、工業生産用にスケールアップして本発明を実施する場合には、当業者は、用いる機械と処理量に応じて適切な破砕時間を設定することができる。本発明の方法に用いることができる工業生産用ミキサーの例は、容量約4000ml、出力1400W程度の業務用のミキサー(ブレンダー)であり、回転数は高速(18,500rpm)、中速(16,300rpm)、低速(14,000rpm)である。さらに大量のスケールで行う場合は特注のブレンダーを使うか、茶葉の量に合わせミキサー操作を繰り返しても良い。生茶葉の破砕は破砕できればどのような機械でも使用可能であり、例えばミキサー、ウルトラマイザー、ハンマーミル、ホモゲナイザーなどを使用できるが特にミキサー(ブレンダー)が好ましい。

水の量
 生茶葉に加える水の量は、使用する茶葉の種類、含有水分、保存状態等によって適宜選択することができるが、好ましくは生茶葉1gに対して5mlから500ml、より好ましくは7mlから200ml、さらに好ましくは10mlから100mlである。5mlより少ないと、収率が低下し、500mlより多いと、酵素反応の効率および生成物の精製効率が低下する。水の量を大量にした場合、テアフラビンまたはテアフラビン類の含量が増大した(実施例2と3の比較、実施例5と6の比較)。

緑茶葉抽出液
 生茶葉中のカテキン量は限られているため、テアフラビン類の収量をさらに高めるためには、生茶葉または冷凍生茶葉に水と緑茶抽出液を加え同様の操作を行うことが望ましい。緑茶抽出液としては、加熱処理した緑茶葉に水を加え抽出した液、加熱処理した緑茶葉に水を加え抽出し濃縮した茶エキスに水を添加した液、茶抽出物に水を添加した液などの、4種類のカテキン類が含まれている水溶液を用いることができる。この場合、生茶葉中の酵素の作用により、生茶葉に含まれるカテキン類と緑茶抽出液に含まれるカテキン類との両方を効率よくテアフラビンに変換でき、より高含量のテアフラビンまたはテアフラビン類を得ることができる。

精製
 得られたテアフラビン類は、反応水溶液を有機溶媒で抽出することにより容易に高純度で回収することができる。例えばクロロホルムでカフェイン(caffeine)を抽出して除去したのち、酢酸エチル、エーテルなどの有機溶媒で抽出することにより、テアフラビン類を高純度で得ることができる。クロマト分離によっても高純度で回収することができる。反応混合物からカフェインと没食子酸を昇華させてテアフラビン類を高純度で回収することができる。反応水溶液の温度を適宜に変える事により分別再結晶によりテアフラビン類を高純度で回収することもできる。以上はテアフラビン類を高純度で得る方法について述べたが、用途によってはテアフラビン類を単離せず、カフェイン及び没食子酸を含む混合物で用いる事も可能である。その場合は従来良く知られた技術、例えばスプレードライ法、凍結乾燥法などを用いて水を除去すれば良い。生成したテアフラビン類の種類および量は、定法にしたがってHPLC等を用いて測定することができる。

 本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書に参照として取り込まれる。

 以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。下記の実施例においては、EC,ECG,EGC,EGCG,TF,TF3G,TF3’GおよびTFDGの分析にはHPLC装置(JASCO(株)、PU-980、UV-970)とODS120A(TOSO, 4.6mm×250mm)カラムを用いた。HPLCの条件は溶媒:アセトニトリル:酢酸エチル:0.05% H₃PO₄ =21:3:76、流速;1.0ml/min、温度;25℃である。検出は、UV280nmでおこなった。それぞれ検量線を作成し測定した。

実施例1
 7月18日採取やぶきた茶葉9.55gに蒸留水100mlを加え、家庭用ミキサーにて1分 間破砕後、100ml三角フラスコに移しアルミホイルにてふたをし24時間静置後吸引ろ取を行 い得られたろ液をHPLCで分析した。100g生葉に換算するとTF 75.2 mg (0.075%), TF3G 14.0mg (0.014%), TF3’G 8.0 mg (0.008%), TFDG 3.9mg (0.004%), EGCG 3.9g (3.9%), ECG 81mg (0.081%), caffeine 499.7 mg (0.5%) である。ろ液をクロロホルムで抽出した水相を酢酸エチルで抽出し、テアフラビン類を11mg(茶葉9.55gあたり)得た。

実施例2
 7月18日採取やぶきた茶葉9.55gに蒸留水100mlを加え、家庭用ミキサーにて1分間破砕後、100ml三角フラスコに移しアルミホイルにてふたをし120時間静置する。吸引ろ取を行い得られたろ液をHPLCで分析した。100g生葉に換算するとTF 444.8 mg (0.44%), caffeine 440 mg (0.44%) である。ろ液をクロロホルムで抽出した水相を酢酸エチルで抽出し、テアフラビンを46 mg (茶葉9.55gあたり)得た。

実施例3
 7月18日採取やぶきた茶葉9.55gに蒸留水800mlを加え、家庭用ミキサーにて1分間破砕後、1000ml三角フラスコに移しアルミホイルにてふたをし120時間静置する。吸引ろ取を行い得られたろ液をHPLC分析した。100g生葉に換算するとTF 850 mg (0.85%), caffeine 435 mg (0.44%) である。ろ液をクロロホルムで抽出した水相を酢酸エチルで抽出し、テアフラビンを 79 mg (茶葉9.55gあたり)得た。

実施例4
 7月18日採取やぶきた茶葉10.91gに蒸留水100mlを加え、家庭用ミキサーにて3分間破砕後、100ml三角フラスコに移しアルミホイルにてふたをし24時間静置後吸引ろ取を行い得られたろ液をHPLCで分析した。100g生葉に換算するとTF 289 mg (0.29%), TF3G 70mg (0.07%), TF3’G 42 mg (0.042%), TFDG 34mg (0.034%), EGCG 3.1g (3.1%), ECG 40.3mg (0.04%), caffeine 355 mg (0.36%) である。ろ液をクロロホルムで抽出した水相を酢酸エチルで抽出し、テアフラビン類を 42 mg (茶葉10.91gあたり)得た。

実施例5
 7月18日採取やぶきた茶葉10.91gに蒸留水100mlを加え、家庭用ミキサーにて3分間破砕後、100ml三角フラスコに移しアルミホイルにてふたをし120時間静置する。吸引ろ取を行い得られたろ液をHPLC分析した。100g生葉に換算するとTF 402 mg (0.4%), TF3G 29.3mg (0.029%), TF3’G 14.9 mg (0.015%), TFDG 9.1mg (0.009%), caffeine 307 mg (0.31%) である。ろ液をクロロホルムで抽出した水相を酢酸エチルで抽出し、テアフラビン類を 53 mg (茶葉10.91gあたり)得た。

実施例6
 7月18日採取やぶきた茶葉9.70gに蒸留水800mlを加え、家庭用ミキサーにて3分間破砕後、1000ml三角フラスコに移しアルミホイルにてふたをし120時間静置する。吸引ろ取を行い得られたろ液をガラスビンに移し、アルミホイルでふたをした後、HPLC分析した。100g生葉に換算するとTF 699 mg (0.7%), TF3G 89.5mg (0.09%), TF3’G 24.5 mg (0.025%), TFDG 38.3mg (0.038%), caffeine 435 mg (0.44%) である。ろ液をクロロホルムで抽出した水相を酢酸エチルで抽出し、テアフラビン類を 85 mg (茶葉9.70gあたり)得た。

実施例7
 6月15日採取したやぶきた茶葉26.68gに蒸留水218mlを加え、家庭用ミキサーにて3分間破砕後、30分間振とう後、吸引ろ取を行い得られたろ液をHPLC分析した。100g生葉に換算するとTF 176 mg (0.18%), TF3G 106 mg (0.11%), TF3’G 74.0 mg (0.074%), TFDG 106 mg (0.11%),caffeine 200 mg (0.20%), EGCG 0 g (0%), ECG 0 mg (0%)である。ろ液をクロロホルムで抽出した水相を酢酸エチルで抽出し4種類のテアフラビン類を 120 mg (茶葉26.68gあたり)得た。

実施例8
 7月23日採取した紅富貴二番茶10.00gに蒸留水100mlを加え、家庭用ミキサーにて5分間破砕後、5分間振とう(120rpm)した後、吸引ろ取を行い得られたろ液をHPLCで分析した。100g生葉に換算するとTF 257 mg (0.26%), TF3G 92.7mg (0.093%), TF3’G 49.2 mg (0.049%), TFDG 48.1mg (0.048%),caffeine 495 mg (0.50%) である。ろ液をクロロホルムで抽出した水相を酢酸エチルで抽出し4種類のテアフラビン類を 41 mg (茶葉10.00 gあたり)得た。

実施例9
 10月7日採取したやぶきた茶葉を4日間室温下放置後の葉14.76gに蒸留水140mlを加え、家庭用ミキサーにて1分間破砕後、37分間振とう(120rpm)した後吸引ろ取を行い得られたろ液をHPLCで分析した。100g生葉に換算するとTF 132.4 mg (0.13%), TF3G 46.0mg (0.046%), TF3’G 33 mg (0.033%), TFDG 24mg (0.024%),caffeine 261 mg (0.26%) である。ろ液をクロロホルムで抽出した水相を酢酸エチルで抽出し4種類のテアフラビン類を 30 mg (茶葉 14.76 gあたり)得た。

 実施例1~9の結果を下記の表にまとめる。
【表1】

実施例10
 冷凍茶葉(6月25採取茶葉)200gに、加熱加工した4番茶(100g)を4リットルの水で抽出した液を加え、工業用ミキサー(High スピード)にて1分間破砕し、工業用スターラーで40分間水面が動かないように静かに撹拌した。粗濾過を行った後、得られたろ液をクロロホルムで抽出してカフェインを除去した後、水相を酢酸エチルにて抽出し、濃縮して、テアフラビン5.2g (HPLC分析80%純度)を得た。

実施例11
 冷凍茶葉(6月25採取茶葉)100gに、加熱加工した4番茶(50g)を2リットルの水で抽出した液を加え、工業用ミキサー(High スピード)にて1分間破砕し、工業用スターラーで30分間水面の中央が渦ができる程度に激しく撹拌した。粗濾過を行った後、得られたろ液をクロロホルムで1回抽出した後、水相を酢酸エチルにて抽出し、濃縮して、テアフラビン類2.0g (HPLC分析:カフェイン9%, TF 24%, TF3G 18%, TF3’G 13%, TFDG 15%)を得た。