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METHOD FOR INTRODUCING MUTATED GENE, GENE HAVING MUTATION INTRODUCED THEREIN, CASSETTE FOR INTRODUCING MUTATION, VECTOR FOR INTRODUCING MUTATION, AND KNOCK-IN NON-HUMAN MAMMAL

Foreign code F110002836
File No. S2009-0052-C0
Posted date May 2, 2011
Country WIPO
International application number 2009JP068729
International publication number WO 2010/047423
Date of international filing Oct 23, 2009
Date of international publication Apr 29, 2010
Priority data
  • P2008-273446 (Oct 23, 2008) JP
Title METHOD FOR INTRODUCING MUTATED GENE, GENE HAVING MUTATION INTRODUCED THEREIN, CASSETTE FOR INTRODUCING MUTATION, VECTOR FOR INTRODUCING MUTATION, AND KNOCK-IN NON-HUMAN MAMMAL
Abstract Disclosed is a method for introducing a mutation into a gene, which comprises the following steps: a homologous recombination step of carrying out the homologous recombination between a target gene into which the mutation is to be introduced and a target recombinant vector, thereby substituting an exon in the target gene into which the mutation is to be introduced by a target DNA sequence in the target recombinant vector; and a mutation introduction step of carrying out the specific recombination between the target DNA sequence in the resulting recombined target gene and a mutation introduction cassette of a mutation introduction vector carrying a mutated DNA sequence containing a mutated exon by the intervening action of Cre recombinase to substitute the target DNA sequence by the mutated DNA in the mutation introduction cassette, thereby producing a mutation-introduced gene into which the mutant DNA sequence has been introduced. The method enables the production of a knock-in non-human animal, such as a knock-in mouse, which carries the mutation-introduced gene.
Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】染色体上の組換え済み標的遺伝子(40)に含まれる互いに異なる第1変異lox配列(30)および第2変異lox配列(36)の対で挟まれた標的DNA配列(32)と、変異導入ベクター(50)の変異導入カセット(51)によって、該変異導入カセット(51)に含まれる互いに異なる第3変異lox配列(52)および第4変異lox配列(56)の対で挟まれた変異導入DNA配列領域(54)とを、Creレコンビナーゼの介在作用によって組換えて導入することを特徴とする遺伝子変異導入方法。

【請求項2】請求項1に記載の遺伝子変異導入方法であって、該組換え済み標的遺伝子(40)が、標的遺伝子(10)と標的組換えベクター(20)との相同組換えで得られた組換え遺伝子であって、互いに異なる第1変異lox配列(30)および第2変異lox配列(36)の対で挟まれた標的DNA配列(32)を含んでいることを特徴とする遺伝子変異導入方法。

【請求項3】請求項1または2に記載の遺伝子変異導入方法であって、該変異導入ベクター(50)の変異導入カセット(51)が、第3変異lox配列(52)および第4変異lox配列(56)の対で挟まれた変異DNA配列(57)と第2ポジティブ選択マーカーDNA配列(58)とを含むことを特徴とする遺伝子変異導入方法。

【請求項4】請求項1ないし3のいずれか1項に記載の遺伝子変異導入方法であって、該変異導入ベクター(50)の変異導入カセット(51)に含まれる第3変異変異lox配列(52)と第4変異変異lox配列(56)との対で挟まれた変異DNA配列(57)が、Creレコンビナーゼの介在作用によって、該組換え済み標的遺伝子(40)に含まれる第1変異lox配列(30)および第2変異lox配列(36)の対で挟まれた標的DNA配列(32)と組換わることを特徴とする遺伝子変異導入方法。

【請求項5】請求項1ないし4のいずれか1項に記載の遺伝子変異導入方法であって、該第1変異lox配列(30)がloxP配列の5’側反復繰り返し配列に変異が存在する変異lox配列、第2変異lox配列(36)がloxP配列のスペーサー配列に変異が存在する変異lox配列、第3変異lox配列(52)がloxP配列の3’側反復繰り返し配列に変異が存在する変異lox配列、および第4変異lox配列(56)がloxP配列のスペーサー配列に変異が存在する変異lox配列であること、を特徴とする遺伝子変異導入方法。

【請求項6】請求項1ないし5のいずれか1項に記載の遺伝子変異導入方法であって、該第1変異lox配列(30)がlox71であり、第2変異lox配列(36)がlox2272であり、第3変異lox配列(52)がloxKR3であり、および第4変異lox配列(56)がlox2272であることを特徴とする遺伝子変異導入方法。

【請求項7】請求項1ないし6のいずれか1項に記載の遺伝子変異導入方法であって、該組換え済み標的遺伝子(40)と変異導入ベクター(50)の変異導入カセット(51)との組換えにより得られた変異導入遺伝子(60)が、第1変異lox配列(30)ならびに第2変異lox配列(36)の対と、該第3変異lox配列(52)ならびに第4変異lox配列(56)の対とのそれぞれの組換えによって得られる第5変異lox配列(64)ならびに第6変異lox配列(66)で挟まれた変異導入DNA配列領域(54)を含み、ならびに該変異導入DNA配列領域(54)が変異DNA配列(57)と第2ポジティブ選択マーカーDNA配列(58)を含むことを特徴とする遺伝子変異導入方法。

【請求項8】請求項7に記載の遺伝子変異導入方法であって、該第5変異lox配列(62)が、loxP配列の5’側および3’側反復繰り返し配列に第1変異lox配列(30)のlox71と第3変異lox配列(36)のloxKR3の変異を併せ持つlox71/KR3であり、および第6変異lox配列(66)がlox2272であることを特徴とする遺伝子変異導入方法。

【請求項9】請求項1ないし8項のいずれか1項に記載の遺伝子変異導入方法であって、該遺伝子変異導入方法が、該標的遺伝子(10)と標的組換えベクター(20)との相同組換えによって、該標的遺伝子(10)の第1DNA配列領域(10a)を、該標的組換えベクター(20)の第2DNA配列領域(20a)と相同組換えして、該第1DNA配列領域(10a)に含まれる変異導入対象エキソン(12)を、該第2DNA配列領域(20a)に含まれる標的DNA配列(32)で組換えて組換え済み標的遺伝子(40)を得ることからなる相同組換え工程と、該組換え済み標的遺伝子(40)の第3DNA配列領域(40a)に含まれる第1変異lox配列(30)と第2変異lox配列(36)の対と、その対で挟まれた変異標的DNA配列領域(35)とを、Creレコンビナーゼと1対の変異型lox配列からなるCre?変異loxシステムの介在作用によって、該変異導入ベクター(50)の変異導入カセット(51)で組換えて変異導入DNA配列領域(54)を導入した変異導入遺伝子(60)を得る変異導入工程と、からなる遺伝子変異導入方法とからなり、
該標的組換えベクター(20)が、ネガティブ選択マーカーDNA配列(22)と、第1相同組換えDNA配列領域(24)と、標的DNA配列領域(26)と、第2相同組換えDNA配列領域(34)とを含むこと、および該標的DNA配列領域(26)が、第1変異lox配列(30)と、標的DNA配列(32)と、第1ポジティブ選択マーカーDNA配列(34)と、第2変異lox配列(36)と、ポリA付加配列(38)とを含み、ならびに該第1および第2相同組換えDNA配列領域(22、28)が相同組換えに必要なDNA配列の長さを有すること;
該組換え済み標的遺伝子(40)の第3DNA配列領域(40a)が、第1相同組換えDNA配列領域(24)と、第1変異lox配列(30)、変異標的DNA配列領域(35)と、第2変異lox配列(36)と、第2相同組換えDNA配列領域(28)とを含み、および変異標的DNA配列領域(35)が、標的DNA配列(32)と、第1ポジティブ選択マーカーDNA配列(34)とを含むこと;
該変異導入ベクター(50)の変異導入カセット(51)が、第3変異lox配列(52)と、変異導入DNA配列領域(54)と、第2変異lox配列(56)と、を含み、ならびに該変異導入DNA配列領域(54)が変異DNA配列(57)と、第2ポジティブ選択マーカーDNA配列(58)とを含むこと;および
該変異導入遺伝子(60)が、第1相同組換えDNA配列領域(24)と、第5変異lox配列(62)と、変異導入DNA配列領域(54)と、第6変異lox配列(66)と、第2相同組換えDNA配列領域(28)と、を含み、ならびに変異導入DNA配列領域(54)が、変異DNA配列(57)と、第2ポジティブ選択マーカーDNA配列(58)とを含むこと、からなること;
を特徴とする遺伝子変異導入方法。

【請求項10】 請求項1ないし9のいずれか1項に記載の遺伝子変異導入方法であって、該変異導入ベクターの変異導入カセット(51)に含まれる変異DNA配列(57)が変異エキソンであることを特徴とする遺伝子変異導入方法。

【請求項11】 請求項1ないし10のいずれか1項に記載の遺伝子変異導入方法であって、該変異導入遺伝子(60)に含まれる変異DNA配列(57)が変異エキソンであることを特徴とする遺伝子変異導入方法。

【請求項12】 請求項1ないし11のいずれか1項に記載の遺伝子変異導入方法であって、該標的遺伝子がヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん(BFNC)関連電位依存性カリウムチャンネルKCNQ2サブユニットの遺伝子由来であることを特徴とする遺伝子変異導入方法。

【請求項13】請求項1ないし12のいずれか1項に記載の遺伝子変異導入方法にあって、該標的遺伝子(10)の標的変異が遺伝子KCNQ2のY284C(配列番号1および2)またはT306A(配列番号3および4)であることを特徴とする遺伝子変異導入方法。

【請求項14】請求項1ないし13のいずれか1項に記載の遺伝子変異導入方法によって標的遺伝子(10)に遺伝子変異を導入して変異導入遺伝子(60)を作製することを特徴とする変異導入遺伝子の作製方法。

【請求項15】第1相同組換えDNA配列領域(24)と、第5変異lox配列(62)と、変異導入DNA配列領域(54)と、第6変異lox配列(66)と、第2相同組換えDNA配列領域(28)と、を含み、ならびに変異導入DNA配列領域(54)が、変異DNA配列(57)と、第2ポジティブ選択マーカーDNA配列(58)とを含み、かつ、第5変異lox配列(62)と第6変異lox配列(66)との対で挟まれている変異導入遺伝子(60)であることを特徴とする変異導入遺伝子。

【請求項16】請求項15に記載の変異導入遺伝子であって、該第5変異lox配列(62)と第6変異lox配列(66)との対が、第1変異lox配列(30)と第2変異lox配列(36)との対と、第3変異lox配列(52)と第4変異lox配列(56)との対との組換えによって得られたものであることを特徴とする変異導入遺伝子。

【請求項17】第3変異lox配列(52)と第4変異lox配列(56)との対およびその対で挟まれた変異DNA配列(57)ならびに第2ポジティブ選択マーカーDNA配列(58)とを含む変異導入カセットであることを特徴とする変異導入カセット。

【請求項18】請求項17に記載の変異導入カセットであって、該第3変異lox配列(52)がloxKR3であり、第4変異lox配列(56)がlox2272であるとともに、変異DNA配列(57)が変異エキソンを含むことを特徴とする変異導入カセット。

【請求項19】請求項17または18に記載の変異導入カセットを含むことを特徴とする変異導入ベクター。

【請求項20】 請求項14に記載の変異導入遺伝子の作製方法で作製した変異導入遺伝子または請求項15もしくは16に記載の変異導入遺伝子が導入されていることを特徴とする変異導入ES細胞。

【請求項21】 請求項14に記載の変異導入遺伝子の作製方法で作製した変異導入遺伝子または請求項15もしくは16に記載の変異導入遺伝子が導入されていることを特徴とするノックイン非ヒト哺乳動物。

【請求項22】請求項21に記載のノックイン非ヒト哺乳動物であって、該ノックイン非ヒト哺乳動物がマウスであることを特徴とするノックイン非ヒト哺乳動物。

【請求項23】 請求項21または22に記載のノックイン非ヒト動物において、該変異遺伝子がヒトの常染色体優性の良性家族性新生児けいれん(BFNC)関連電位依存性カリウムチャンネルの遺伝子KCNQ2サブユニット由来であることを特徴とするノックイン非ヒト哺乳動物。

【請求項24】 請求項18ないし23のいずれか1項に記載のノックイン非ヒト哺乳動物において、該変異遺伝子が変異遺伝子KCNQ2のY284CまたはT306Aであることを特徴とするノックイン非ヒト動物。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • Fukuoka University
  • National University Corporation Kumamoto University
  • Inventor
  • HIROSE Shinichi
  • DESHIMARU Masanobu
  • ARAKI Yoshimi
IPC(International Patent Classification)
Specified countries AE(UTILITY MODEL),AG,AL(UTILITY MODEL),AM(PROVISIONAL PATENT)(UTILITY MODEL),AO(UTILITY MODEL),AT(UTILITY MODEL),AU,AZ(UTILITY MODEL),BA,BB,BG(UTILITY MODEL),BH(UTILITY MODEL),BR(UTILITY MODEL),BW(UTILITY MODEL),BY(UTILITY MODEL),BZ(UTILITY MODEL),CA,CH,CL(UTILITY MODEL),CN(UTILITY MODEL),CO(UTILITY MODEL),CR(UTILITY MODEL),CU(INVENTOR'S CERTIFICATE),CZ(UTILITY MODEL),DE(UTILITY MODEL),DK(UTILITY MODEL),DM,DO(UTILITY MODEL),DZ,EC(UTILITY MODEL),EE(UTILITY MODEL),EG(UTILITY MODEL),ES(UTILITY MODEL),FI(UTILITY MODEL),GB,GD,GE(UTILITY MODEL),GH(UTILITY CERTIFICATE),GM,GT(UTILITY MODEL),HN,HR(CONSENSUAL PATENT),HU(UTILITY MODEL),ID,IL,IN,IS,KE(UTILITY MODEL),KG(UTILITY MODEL),KM,KN,KP(INVENTOR'S CERTIFICATE)(UTILITY MODEL),KR(UTILITY MODEL),KZ(PROVISIONAL PATENT)(UTILITY MODEL),LA,LC,LK,LR,LS(UTILITY MODEL),LT,LU,LY,MA,MD(UTILITY MODEL),ME,MG,MK,MN,MW,MX(UTILITY MODEL),MY(UTILITY-INNOVATION),MZ(UTILITY MODEL),NA,NG,NI(UTILITY MODEL),NO,NZ,OM(UTILITY MODEL),PE(UTILITY MODEL),PG,PH(UTILITY MODEL),PL(UTILITY MODEL),PT(UTILITY MODEL),RO,RS(PETTY PATENT),RU(UTILITY MODEL),SC,SD,SE,SG,SK(UTILITY MODEL),SL(UTILITY MODEL),SM,ST,SV(UTILITY MODEL),SY,TJ(UTILITY MODEL),TM(PROVISIONAL PATENT),TN,TR(UTILITY MODEL),TT(UTILITY CERTIFICATE),TZ,UA(UTILITY MODEL),UG(UTILITY CERTIFICATE),US,UZ(UTILITY MODEL),VC(UTILITY CERTIFICATE),VN(PATENT FOR UTILITY SOLUTION),ZA,ZM,ZW,EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF(UTILITY MODEL),BJ(UTILITY MODEL),CF(UTILITY MODEL),CG(UTILITY MODEL),CI(UTILITY MODEL),CM(UTILITY MODEL),GA(UTILITY MODEL),GN(UTILITY MODEL),GQ(UTILITY MODEL),GW(UTILITY MODEL),ML(UTILITY MODEL),MR(UTILITY MODEL),NE(UTILITY MODEL),SN(UTILITY MODEL),TD(UTILITY MODEL),TG(UTILITY MODEL)),AP(BW(UTILITY MODEL),GH(UTILITY MODEL),GM(UTILITY MODEL),KE(UTILITY MODEL),LS(UTILITY MODEL),MW(UTILITY MODEL),MZ(UTILITY MODEL),NA(UTILITY MODEL),SD(UTILITY MODEL),SL(UTILITY MODEL),SZ(UTILITY MODEL),TZ(UTILITY MODEL),UG(UTILITY MODEL),ZM(UTILITY MODEL),ZW(UTILITY MODEL)),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM)

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