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RETROGRADE TRANSPORT VIRAL VECTOR SYSTEM HAVING ENVELOPE COMPRISING FUSED GLYCOPROTEIN

Foreign code F110003181
File No. A301-01WO
Posted date Jun 22, 2011
Country WIPO
International application number 2010JP070136
International publication number WO 2011068019
Date of international filing Nov 11, 2010
Date of international publication Jun 9, 2011
Priority data
  • P2009-274156 (Dec 2, 2009) JP
Title RETROGRADE TRANSPORT VIRAL VECTOR SYSTEM HAVING ENVELOPE COMPRISING FUSED GLYCOPROTEIN
Abstract Provided is a lentiviral vector system which sustains a high-frequency retrograde transportation ability in animal brain and has a higher titer. A kit for preparing a retrograde transport viral vector, which comprises: (1) a packaging plasmid containing the gag gene and pol gene of HIV-1; (2) a packaging plasmid containing an accessory gene of HIV-1; (3) a transfer plasmid containing a target gene; and (4) an envelope plasmid containing, as an envelope gene, a gene encoding a fused polypeptide comprising the extracellular domain of rabies virus glycoprotein (RV-G), the transmembrane domain of rabies virus glycoprotein (RV-G) or vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) and the intracellular domain of vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G).
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Non-proliferating (non-replicating) type recombinant vectors is, a gene of interest in the central nervous system (CNS) transport non-dividing cells and maintain the expression system over the long term gene therapy for various diseases such as many as vectors for used in the study (non-patent document 1-4). In particular, vectors derived from primate HIV-1 (human immunodeficiency virus type 1) as vectors for gene therapy is of value that the best (non-patent document 5-8).
On the other hand, certain gene for for the treatment of neurodegenerative disorders, nerve endings in the infected site, transported in a retrograde fashion axons, such infection site located at a remote location at the target site is a gene of interest is introduced into the cell body can be a viral vector (Fig. 1) is beneficial.
So far, as the envelope glycoprotein (envelope gene protein), vesicular stomatitis virus (vesicular stomatitis virus: VSV) glycoprotein (VSV-G) (pseudotyped: pseudotyped) using recombinant virus using HIV-1, cynomolgus retrograde transport in the brain has been systems have been developed, retrograde transport of this vector is efficient (non-patent document 9) is not. In the method described in this document, the result was confirmed by immunostaining, injected to the striatum of the monkey recombinant HIV-1 in a retrograde fashion viruses in infected cells of the central nervous system had a slight.
On the other hand, rabies virus (rabies virus: RV) is, more infected the synaptic terminal, transported in a retrograde fashion axons activity that is known. In fact, equine anemia virus RV-G by retrograde transport of a non-primate vectors based on the ability is increased by have been reported (non-patent document 10, patent document 1 and 11).
Further, RV-G pseudotyped lentiviral HIV-1 was reported (non-patent document 3) but, in practice this report in an animal experiment (in vivo) using viral vectors is not performed. In addition, cause the nerves of rabies virus in a one-way, or glycoprotein (Mokola lyssavirus) moko larissa virus VSV-G pseudotyped HIV-1 and gene transfer vectors have been studied in the CNS. Glycoprotein or moko larissa virus pseudotyped with the VSV-G vector was injected into the rats nostril HIV-1 as a result, with respect to retrograde transport to the olfactory system, these vectors can be comparable to each other (non-patent document 12). In addition, this document discloses that the viral vector was administered via the striatum has not been described the.
The present inventors have thus far, of the rabies virus glycoprotein gene (RV-G) lentiviruses pseudotyped HIV-1 in vector (vector RV-G/HIV-1) thus produced, various high frequency can be in the region in the brain to allow retrograde gene transfer revealed (Patent Document 2, Hum. Gene Ther., 2007).
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲 [請求項1]
(1)HIV-1のgag 及びpol遺伝子を含むパッケージングプラスミド;
(2)HIV-1のアクセサリー遺伝子を含むパッケージングプラスミド;
(3)目的遺伝子を含むトランスファープラスミド;及び
(4)エンベロープ遺伝子として、狂犬病ウィルスの糖タンパク質(RV-G)の細胞外ドメイン、狂犬病ウィルスの糖タンパク質(RV-G)又は水泡性口内炎ウィルスの糖タンパク質 (VSV-G) の膜貫通ドメイン、及び、水泡性口内炎ウィルスの糖タンパク質 (VSV-G)の細胞内ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする遺伝子を含むエンベローププラスミド、を含む逆行輸送性ウィルスベクター調製用キット。

[請求項2]
融合ポリペプチドが配列番号2又は配列番号6に示されたアミノ酸配列を有し、パッケージングプラスミド(1)がpCAGkGP1.1Rであり、パッケージングプラスミド(2)がpCAG4-RTR2であり、且つ、トランスファープラスミドがpCL20c-MSCV-X(ここで、「X」は目的遺伝子を示す)であることを特徴とする、請求項1記載のウィルスベクター調製用キット。

[請求項3]
エンベローププラスミドにおいて、エンベロープ遺伝子がサイトメガロウィルスエンハンサー及びトリβアクチンプロモーターの制御下で発現する、請求項1又は2記載のウィルスベクター調製用キット。

[請求項4]
融合ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列が配列番号1又は配列番号5に示されたものである、請求項3記載のウィルスベクター調製用キット。

[請求項5]
目的遺伝子がヒトの遺伝子である、請求項1~4のいずれか一項に記載ウィルスベクター調製用キット。

[請求項6]
目的遺伝子が脳神経疾患治療用の遺伝子である、請求項5に記載のウィルスベクター調製用キット。

[請求項7]
請求項1~6のいずれか一項に記載のウィルスベクター調製用キット、及び、宿主細胞を含む、プロデューサー細胞作製用キット。

[請求項8]
感染細胞がHEK293T細胞である、請求項7記載のキット。

[請求項9]
請求項1~6のいずれか一項に記載のウィルスベクター調製用キットに含まれる、パッケージングプラスミド、トランスファープラスミド、及び、エンベローププラスミドを感染細胞にコトランスフェクションさせることから成る、プロデューサー細胞の作製方法。

[請求項10]
感染細胞がHEK293T細胞である、請求項9記載の作製方法。

[請求項11]
リン酸カルシウム法を用いてトランスフェクションする、請求項9又は10記載の作製方法。

[請求項12]
請求項9~11で得られたプロデューサー細胞。

[請求項13]
請求項12記載のプロデューサー細胞を培養し、培養上清からウィルス粒子を回収することからなる、ウィルスベクターの製造方法。

[請求項14]
請求項13記載の方法によって製造された、逆行性輸送能を有するウィルスベクター。

[請求項15]
請求項14記載のウィルスベクターを動物の神経終末部に感染させ、該ウィルスベクターが該神経の軸索を逆行性に輸送されることにより脳内の標的領域にある該神経の細胞体に導入し、目的とする遺伝子を該細胞体内で発現させることから成る、遺伝子導入方法。

[請求項16]
神経終末部が線条体にあり、脳内の標的領域が線条体に投射する脳中枢領域である、請求項15記載の遺伝子導入方法。

[請求項17]
線条体に投射する脳中枢領域が一次運動皮質、一次体性感覚皮質、視床束傍核、及び/又は、黒質緻密部である、請求項16記載の方法。

[請求項18]
腹側線条体(側坐核)に投射する脳中枢領域が梨状皮質、鉤状回、扁桃体基底外側核、室傍核前部、視床背内側核、及び/又は、外側視床下部である、請求項16記載の方法。

[請求項19]
動物が哺乳類である、請求項15~18のいずれか一項に記載の方法。

[請求項20]
哺乳類が霊長類である、請求項19記載の方法。

[請求項21]
哺乳類がヒトである、請求項20記載の方法。

[請求項22]
請求項15記載のウィルスベクターを活性成分として含有する、遺伝子治療剤。

[請求項23]
請求項15~21記載の方法で導入された目的遺伝子が標的領域における細胞の染色体に組み込まれ発現することを含む、脳疾患の遺伝子治療方法。

[請求項24]
請求項21記載の遺伝子治療剤を患者に投与することを含む、請求項22記載の治療方法。

[請求項25]
脳疾患がパーキンソン病である、請求項23又は24記載の治療方法。

[請求項26]
狂犬病ウィルスの糖タンパク質(RV-G)の細胞外ドメイン及び膜貫通ドメイン並びに水泡性口内炎ウィルスの糖タンパク質(VSV-G)の細胞内ドメインを含む融合ポリペプチドから成る、レンチウィルスベクターのシュードタイプ化用のエンベロープ。

[請求項27]
レンチウィルスベクターがHIV-1レンチウィルスである、請求項26記載のエンベロープ。

[請求項28]
請求項26又は27記載の融合ポリペプチドから成るエンベロープをコードする遺伝子。

[請求項29]
請求項28記載の遺伝子を含むエンベローププラスミド。

  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • Japan Science and Technology Agency
  • Inventor
  • KOBAYASHI Kazuto
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IS KE KG KM KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LT LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PE PG PH PL PT RO RS RU SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG
Reference ( R and D project ) (In Japanese)CREST 脳の機能発達と学習メカニズムの解明 領域
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