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METHOD FOR SCREENING MONOCLONAL ANTIBODY RECOGNIZING THREE-DIMENSIONAL STRUCTURE OF MEMBRANE PROTEIN

Foreign code F110003195
File No. E08402WO
Posted date Jun 22, 2011
Country WIPO
International application number 2010JP057631
International publication number WO 2010/126115
Date of international filing Apr 28, 2010
Date of international publication Nov 4, 2010
Priority data
  • P2009-110994 (Apr 30, 2009) JP
Title METHOD FOR SCREENING MONOCLONAL ANTIBODY RECOGNIZING THREE-DIMENSIONAL STRUCTURE OF MEMBRANE PROTEIN
Abstract Disclosed is a method for screening an antibody which is to be co-crystallized with a membrane protein. Specifically disclosed is a liposome-membrane protein complex which is used for screening an antibody to be co-crystallized with a membrane protein, comprising: a solid phase support; a liposome binding to said solid phase support; and a membrane protein embedded in said liposome, wherein at least a part of said membrane protein is exposed on the outer surface of the liposome.
Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】 リポソーム/膜蛋白質複合体であって、
 固相担体と、
 前記固相担体に結合しているリポソームと、
 前記リポソームに埋め込まれている膜蛋白質と、
 を備え、
 前記膜蛋白質の少なくとも一部が、リポソームの外側表面に露出しており、
 膜蛋白質とともに共結晶化するための抗体をスクリーニングする際に用いられる、リポソーム/膜蛋白質複合体。

【請求項2】 請求項1に記載のリポソーム/膜蛋白質複合体において、
 前記リポソームに埋め込まれているリンカーをさらに備え、
 前記リポソームが、前記リンカーを介して前記固相担体に結合している、
 リポソーム/膜蛋白質複合体。

【請求項3】 請求項1に記載のリポソーム/膜蛋白質複合体において、
 前記膜蛋白質が、受容体蛋白質、チャネル蛋白質、輸送体蛋白質、接着分子、膜結合性酵素からなる群から選ばれる膜蛋白質、またはその塩である、
 リポソーム/膜蛋白質複合体。

【請求項4】 請求項1に記載のリポソーム/膜蛋白質複合体において、
 前記膜蛋白質が、複数回膜貫通型の膜蛋白質である、
 リポソーム/膜蛋白質複合体。

【請求項5】 請求項1に記載のリポソーム/膜蛋白質複合体において、
 前記膜蛋白質が、7回以上膜を貫通している膜蛋白質である、
 リポソーム/膜蛋白質複合体。

【請求項6】 請求項1に記載のリポソーム/膜蛋白質複合体において、
 前記膜蛋白質が、G蛋白質共役受容体である、
 リポソーム/膜蛋白質複合体。

【請求項7】 リポソーム/膜蛋白質複合体であって、
 固相担体と、
 前記固相担体に結合しているリポソームと、
 前記リポソームに埋め込まれている膜蛋白質と、
 を備え、
 前記膜蛋白質の少なくとも一部が、リポソームの外側表面に露出しており、
 膜蛋白質とともに共結晶化する化合物をスクリーニングする際に用いられる、リポソーム/膜蛋白質複合体。

【請求項8】 請求項1に記載のリポソーム/膜蛋白質複合体の生産方法であって、
  a)脂質溶液とリンカーと前記膜蛋白質と界面活性剤とを含有する水溶液を混合し、混合液を作製する工程と、
  b)前記混合液に界面活性剤除去剤を加え、前記混合液中の前記界面活性剤を前記界面活性剤除去剤に吸着させ、前記リンカーおよび前記膜蛋白質が埋め込まれているリポソームを生成する工程と、さらに、
  c)前記リポソームを前記リンカーを介して前記固相担体に結合させ、前記リポソーム/膜蛋白質複合体を生成する工程と、
 を含む、リポソーム/膜蛋白質複合体の生産方法。

【請求項9】 抗体のスクリーニング方法であって、
  d)請求項1に記載のリポソーム/膜蛋白質複合体に、被検抗体を接触させる工程と、
  e)工程d)で結合した抗体を検出する工程と、
  f)前記膜蛋白質を変性させる工程と、
  g)工程f)で変性した変性型の膜蛋白質に、被検抗体を接触させる工程と、
  h)工程g)で結合した抗体を検出する工程と、
 を含む、膜蛋白質とともに共結晶化するための抗体のスクリーニング方法。

【請求項10】 請求項9に記載のスクリーニング方法の工程f)と工程g)と工程h)を含む工程が、
 さらに、ドットブロッティング法、ウエスタンブロッティング法、免疫ブロッティング法、またはELISA法を用いた工程を含む、
 スクリーニング方法。

【請求項11】 抗体のスクリーニング方法であって、
  i)請求項1に記載のリポソーム/膜蛋白質複合体に、抗体ライブラリーを接触させる工程と、
  j)工程i)で結合した抗体を選抜する工程と、
  k)前記膜蛋白質を変性させる工程と、
  l)工程k)で変性した変性型の膜蛋白質に、工程j)で選抜した抗体を接触させる工程と、
  m)工程l)で結合した抗体を除外する工程と、
 を含む、膜蛋白質とともに共結晶化するための抗体のスクリーニング方法。

【請求項12】 抗体のスクリーニング用キットであって、
 膜蛋白質と脂質とリンカーと固相担体と、
 を含む、膜蛋白質とともに共結晶化するための抗体のスクリーニング用キット。

【請求項13】 請求項12に記載のスクリーニング用キットであって、
 さらに、蛋白質変性剤と、
 ドットブロッティング法、ウエスタンブロッティング法、免疫ブロッティング法、またはELISA法のいずれかの方法に使用する試薬と、
 を含む、スクリーニング用キット。

【請求項14】 抗体の生産方法であって、
  n)請求項9に記載のスクリーニング方法によって、膜蛋白質とともに共結晶化するための抗体をスクリーニングする工程と、
  o)工程n)でスクリーニングされた前記膜蛋白質とともに共結晶化するための抗体の、複製物を作製する工程と、
 を含む、膜蛋白質とともに共結晶化するための抗体の生産方法。

【請求項15】 請求項14に記載の生産方法で得られる、抗体。

【請求項16】 リポソーム/膜蛋白質複合体であって、
 固相担体と、
 前記固相担体に結合しているリポソームと、
 前記リポソームに埋め込まれている膜蛋白質と、
 を備え、
 前記膜蛋白質の少なくとも一部が、リポソームの外側表面に露出しており、
 膜蛋白質のループ部分を認識する抗体をスクリーニングする際に用いられる、リポソーム/膜蛋白質複合体。

【請求項17】 抗体のスクリーニング方法であって、
  p)抗体産生細胞から、被検抗体を作製する工程と、
  q)請求項16に記載の前記リポソーム/膜蛋白質複合体に対する、前記被検抗体の結合性を検査し、前記リポソーム/膜蛋白質複合体に結合性を有するリポソーム/膜蛋白質複合体結合性抗体を選抜する工程、
 を含む、膜蛋白質のループ部分を認識する抗体のスクリーニング方法。

【請求項18】 請求項17に記載のスクリーニング方法であって、
  r)前記膜蛋白質またはその複製物を変性させ、変性型膜蛋白質を調整する工程と、
  s)前記変性型膜蛋白質に対する、前記被検抗体または前記リポソーム/膜蛋白質複合体結合性抗体の結合性を検査し、前記リポソーム/膜蛋白質複合体に結合性を有し、前記変性型膜蛋白質に結合性を有しない抗体を、選抜する工程と、
 をさらに含む、スクリーニング方法。

【請求項19】 抗体の生産方法であって、
  t)請求項17に記載のスクリーニング方法によって、膜蛋白質のループ部分を認識する抗体をスクリーニングする工程と、
  u)工程t)でスクリーニングされた前記膜蛋白質のループ部分を認識する抗体の、複製物を作製する工程と、
 を含む、膜蛋白質のループ部分を認識する抗体の生産方法。

【請求項20】 請求項19に記載の抗体の生産方法であって、工程u)の前記複製物が、
 工程p)の前記抗体産生細胞を用いて作製される複製物である、生産方法。

【請求項21】 請求項19に記載の抗体の生産方法であって、工程u)の前記複製物が、
 工程p)の前記抗体産生細胞が含有する、膜蛋白質のループ部分を認識する抗体のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドまたはその機能的変異体、を導入した細胞を使用して作製される複製物である、生産方法。

【請求項22】 請求項19に記載の生産方法で得られる、抗体。

【請求項23】 リポソーム/膜蛋白質複合体であって、
 固相担体と、
 前記固相担体に結合しているリポソームと、
 前記リポソームに埋め込まれている膜蛋白質と、
 を備え、
 前記膜蛋白質の少なくとも一部が、リポソームの外側表面に露出しており、
 膜蛋白質の野生型に対して結合性を有し、膜蛋白質のループ部分変異型に対して結合性を有しない抗体、膜蛋白質に対する解離定数が1.0×10-8M以下の抗体、および膜蛋白質と抗体を合わせた全体の熱安定性を高める抗体、からなる群から選ばれる1種以上の抗体をスクリーニングする際に用いられる、リポソーム/膜蛋白質複合体。

【請求項24】 抗体のスクリーニング方法であって、
  v)抗体産生細胞から、被検抗体を作製する工程と、
  w)固相担体と、前記固相担体に結合しているリポソームと、前記リポソームに埋め込まれている膜蛋白質と、を備え、前記膜蛋白質の少なくとも一部が、リポソームの外側表面に露出している、リポソーム/膜蛋白質複合体に対する、前記被検抗体の結合性を検査し、前記リポソーム/膜蛋白質複合体に結合性を有するリポソーム/膜蛋白質複合体結合性抗体を選抜する工程と、
 を含む、膜蛋白質の野生型に対して結合性を有し、膜蛋白質のループ部分変異型に対して結合性を有しない抗体、膜蛋白質に対する解離定数が1.0×10-8M以下の抗体、および膜蛋白質と抗体を合わせた全体の熱安定性を高める抗体、からなる群から選ばれる1種以上の抗体のスクリーニング方法。

【請求項25】 請求項24に記載のスクリーニング方法であって、
  x)前記膜蛋白質またはその複製物を変性させ、変性型膜蛋白質を調整する工程と、
  y)前記変性型膜蛋白質に対する、前記被検抗体または前記リポソーム/膜蛋白質複合体結合性抗体の結合性を検査し、前記リポソーム/膜蛋白質複合体に結合性を有し、前記変性型膜蛋白質に結合性を有しない、抗体を選抜する工程と、
 をさらに含む、スクリーニング方法。

【請求項26】 抗体の生産方法であって、
  z)請求項24に記載のスクリーニング方法によって、膜蛋白質の野生型に対して結合性を有し、膜蛋白質のループ部分変異型に対して結合性を有しない抗体、膜蛋白質に対する解離定数が1.0×10-8M以下の抗体、および膜蛋白質と抗体を合わせた全体の熱安定性を高める抗体、からなる群から選ばれる1種以上の抗体をスクリーニングする工程と、
  a’)工程z)でスクリーニングされた前記抗体の、複製物を作製する工程と、
 を含む、膜蛋白質の野生型に対して結合性を有し、膜蛋白質のループ部分変異型に対して結合性を有しない抗体、膜蛋白質に対する解離定数が1.0×10-8M以下の抗体、および膜蛋白質と抗体を合わせた全体の熱安定性を高める抗体、からなる群から選ばれる1種以上の抗体の生産方法。

【請求項27】 請求項26に記載の生産方法で得られる、抗体。

【請求項28】 リポソーム/膜蛋白質複合体であって、
 固相担体と、
 前記固相担体に結合しているリポソームと、
 前記リポソームに埋め込まれている膜蛋白質と、
 を備え、
 前記膜蛋白質の少なくとも一部が、リポソームの外側表面に露出しており、
 膜蛋白質のループ部分に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする際に用いられる、リポソーム/膜蛋白質複合体。

【請求項29】 化合物のスクリーニング方法であって、
  b’)請求項28に記載のリポソーム/膜蛋白質複合体に対する、被検化合物の結合性を検査し、前記リポソーム/膜蛋白質複合体に結合性を有するリポソーム/膜蛋白質複合体結合性化合物を選抜する工程、
 を含む、膜蛋白質のループ部分に対して特異的に結合する化合物のスクリーニング方法。

【請求項30】 化合物の生産方法であって、
  c’)請求項29に記載のスクリーニング方法によって、膜蛋白質のループ部分に対して特異的に結合する化合物をスクリーニングする工程と、
  d’)工程c’)でスクリーニングされた前記膜蛋白質のループ部分に対して特異的に結合する化合物の、複製物を作製する工程と、
 を含む、膜蛋白質のループ部分に対して特異的に結合する化合物の生産方法。

【請求項31】 請求項30に記載の生産方法で得られる、化合物。

【請求項32】 アデノシン受容体A2aの立体構造を認識する、アデノシン受容体A2a結合性抗体。

【請求項33】 糖トランスポーターの立体構造を認識する、糖トランスポーター結合性抗体。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • Japan Science and Technology Agency
  • Inventor
  • HINO Tomoya
  • MURATA Takeshi
  • ARAKAWA Takatoshi
  • NOMURA Norimichi
  • KOBAYASHI Takuya
  • IWATA So
IPC(International Patent Classification)
Reference ( R and D project ) ERATO IWATA Human Receptor Crystallography AREA
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