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METHOD FOR MEASURING AUTOPHAGY

Foreign code F110003198
File No. E08803WO
Posted date Jun 22, 2011
Country WIPO
International application number 2010JP063787
International publication number WO 2011/019082
Date of international filing Aug 10, 2010
Date of international publication Feb 17, 2011
Priority data
  • P2009-185639 (Aug 10, 2009) JP
Title METHOD FOR MEASURING AUTOPHAGY
Abstract Disclosed is a method for measuring autophagy in cells, comprising: using, as a fluorescent probe reagent, a single fluorescent protein which is resistant against degrading enzyme activity in lysosome or vacuole, not denatured or inactivated in acidic to neutral pH environment, and can change excitation spectra or fluorescence spectra when located in different environments, i.e., the acidic region and the neutral region; and measuring a change in the fluorescent properties of the probe reagent depending on a pH change relating to autophagy to thereby determine the presence or activity of the autophagy.
Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】 細胞内のオートファジーをインビトロで測定する方法であって、リソソームまたは液胞内での分解酵素活性に耐性があり、pHが酸性から中性の環境下で変性または失活せず、かつ、酸性域と中性域の環境に置かれたときに励起スペクトルまたは蛍光スペクトルを変化させることができる単一の蛍光蛋白質をプローブ試薬として使用して、オートファジーに関連したpHの変化に依存した蛍光プローブ試薬の蛍光特性の変化を測定し、これによってオートファジーの存在または活性を測定することを含む、ただし該蛍光特性の変化を2波長励起1波長蛍光測定または1波長励起2波長蛍光測定によって行い、このとき2つの異なる励起波長または2つの異なる蛍光波長で蛍光強度を測定しそのレシオ(比率)を決定することを特徴とする、前記方法。

【請求項2】 前記オートファジーの存在または活性が、前記細胞内でリソソームまたは液胞内へ移行したプローブ試薬の存在またはその量として測定される、請求項1に記載の方法。

【請求項3】 前記酸性から中性の環境が、少なくともpH4~8の環境である、請求項1または2に記載の方法。

【請求項4】 前記蛍光蛋白質が、コモンサンゴ(Montipola sp.)由来の蛍光蛋白質またはそれと同等の蛍光特性をもつその変異体である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。

【請求項5】 前記蛍光蛋白質が、目的の内在性蛋白質と、場合によりリンカーを介して、結合されたコンジュゲートの形態で前記細胞内に存在する、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。

【請求項6】 前記内在性蛋白質が、疾患関連蛋白質である、請求項5に記載の方法。

【請求項7】 前記蛍光蛋白質が、オルガネラへ選択的に移行させるための移行シグナル配列と結合されたコンジュゲートの形態で前記細胞内に存在する、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。

【請求項8】 前記蛍光蛋白質または前記コンジュゲートが、該蛍光蛋白質またはコンジュゲートをコードするDNAを含む発現ベクターの形態で前記細胞内に導入される、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。

【請求項9】 オートファジー異常を原因とする疾患の治療薬のスクリーニング方法であって、該疾患と関連する細胞に、リソソームまたは液胞内での分解酵素活性に耐性があり、pHが酸性から中性の環境下で変性または失活せず、かつ、酸性域と中性域の環境に置かれたときに励起スペクトルまたは蛍光スペクトルを変化させることができる単一の蛍光蛋白質を含むプローブ試薬と、候補薬剤とを導入し、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法を用いて、該細胞のオートファジー活性を測定し、該活性が対照と比べて増加したとき該候補薬剤が治療効果を有すると決定することを含む、前記方法。

【請求項10】 前記疾患が、神経変性疾患である、請求項9に記載の方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY
  • Inventor
  • MIYAWAKI, Atsushi
  • KATAYAMA, Hiroyuki
IPC(International Patent Classification)
Reference ( R and D project ) ERATO MIYAWAKI Life Function Dynamics AREA
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