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NOVEL UBIQUITIN LIGASE AND USE THEREOF

Foreign code F110005894
File No. 5093,S2011-0390-N0
Posted date Nov 9, 2011
Country WIPO
International application number 2010JP063345
International publication number WO 2011016540
Date of international filing Aug 6, 2010
Date of international publication Feb 10, 2011
Priority data
  • P2009-184878 (Aug 7, 2009) JP
Title NOVEL UBIQUITIN LIGASE AND USE THEREOF
Abstract Disclosed is a novel ubiquitin ligase which has an activity of forming a linear polyubiquitin chain and can be expressed and purified with high efficiency. Specifically disclosed is a complex of (a) a protein comprising a part of HOIP and containing at least a UBA region and a RING-IBR-RING region and (b) at least one protein capable of forming a complex with the component (a). It is found that the complex is a novel ubiquitin ligase which has an activity of forming a linear polyubiquitin chain and can be expressed and purified with high efficiency.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Ubiquitin activating enzymes (E1) modified system, (E2) ubiquitin conjugating enzyme, ubiquitin ligase (E3) by the action of the enzyme of the group 3, ubiquitin ligase is selected to selectively identify the substrate, largely on the protein ubiquitin like a polyubiquitin chain is added to each other to form a, controls the functions of the protein post-translational modification system. Initially is found, a poly - ubiquitinated proteins all comprise the decomposition has been believed to be directed, enlarged concept is that, at present a variety of manner to control the function of the protein has been elucidated. Binding modes on a living body between the various kinds of poly-ubiquitin chain exist, depending on the type thereof modified proteins control mode are different being. Conventional ubiquitin-ubiquitin chains of the lysine side chain via isodesmosine produced by has been considered, the present inventors have N-terminal methionine N through a linear polyubiquitin chain is formed, and, a linear poly-ubiquitination is NF-κB involves activation of the shown ahead of the world.
Specifically, the present inventors, and complex HOIP HOIL-1L-ubiquitin chains are straight-chained found to generate a ubiquitin ligase, and a complex HOIP HOIL-1L designated LUBAC(linear ubiquitin chain assemble complex) (see non-patent document 1). In addition, the ubiquitin ligase LUBAC, classical pathway activation in NF-κB, IκB kinase involved in the stage, IκB kinase IKK complexes NEMO (NF-κ B essential modulator) ubiquitination in a linear, NF-κB causes selective activation of the revealed (see non-patent document 2).
The present inventors have further, linear polyubiquitin chains also Sharpin to found that a component of a ubiquitin ligase, Sharpin, two proteins of 3 and HOIP HOIL-1L, or HOIP HOIP HOIL-1L Sharpin and two proteins of 2 and or a ubiquitin ligase complex and will be referred to as LUBAC. With respect to Sharpin, cpdm natural mutant mice have called mouse Sharpin, or chronic dermatitis of the immune system such as deletions of a Peyer's exhibit symptoms of abnormality or the like have been reported (see non-patent document 3).
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
 以下の(a)および(b)の複合体からなるユビキチンリガーゼ。
(a)HOIPの一部からなり、少なくともUBA領域およびRING-IBR-RING領域を含むタンパク質
(b)前記(a)と複合体を形成する1種または2種以上のタンパク質

[請求項2]
 前記(b)が、HOIPのUBA領域と結合可能な領域を含むタンパク質である請求項1に記載のユビキチンリガーゼ。

[請求項3]
 前記(b)が、以下の(1)および/または(2)である請求項2に記載のユビキチンリガーゼ。
(1)HOIL-1L、もしくは、HOIL-1Lの一部からなり少なくともUBL領域を含むタンパク質
(2)Sharpin、もしくは、Sharpinの一部からなり少なくともUBL領域を含むタンパク質

[請求項4]
 前記(1)が、配列番号5で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号5で表わされるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質であり、前記(2)が、配列番号12で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号12で表わされるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項3に記載のユビキチンリガーゼ。

[請求項5]
 前記(a)が、配列番号7で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号7で表わされるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質である請求項1に記載のユビキチンリガーゼ。

[請求項6]
 以下の(A)および/または(B)をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
(A)HOIPの一部からなり、少なくともUBA領域およびRING-IBR-RING領域を含み、下記(B)と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質
(B)前記(A)と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現する1種または2種以上のタンパク質

[請求項7]
 前記(B)が、HOIPのUBA領域と結合可能な領域を含み、前記(A)と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質である請求項6に記載の発現ベクター。

[請求項8]
 前記(B)が、以下の(I)および/または(II)である請求項7に記載の発現ベクター。
(I)HOIL-1L、もしくは、HOIL-1Lの一部からなり、少なくともUBL領域を含み、前記(A)と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質
(II)Sharpin、もしくは、Sharpinの一部からなり、少なくともUBL領域を含み、前記(A)と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質

[請求項9]
 前記(I)が、配列番号5で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号5で表わされるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記(A)と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質であり、前記(II)が、配列番号12で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号12で表わされるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記(A)と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質である請求項8に記載の発現ベクター。

[請求項10]
 前記(A)が、配列番号7で表わされるアミノ酸配列からなるタンパク質、または、配列番号7で表わされるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記(B)と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質である請求項6に記載の発現ベクター。

[請求項11]
 前記(I)をコードするポリヌクレオチドが、配列番号6で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号6で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記(A)と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであり、前記(II)をコードするポリヌクレオチドが、配列番号13で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号13で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記(A)と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである請求項9に記載の発現ベクター。

[請求項12]
 前記(A)をコードするポリヌクレオチドが、配列番号8で表わされる塩基配列からなるポリヌクレオチド、または、配列番号8で表わされる塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、前記(B)と複合体を形成してユビキチンリガーゼ活性を発現するタンパク質をコードするポリヌクレオチドである請求項10に記載の発現ベクター。

[請求項13]
 請求項6~12のいずれかに記載の発現ベクターが導入された形質転換体。

[請求項14]
 被験物質を請求項1~5のいずれかに記載のユビキチンリガーゼと接触させる工程と、
 前記ユビキチンリガーゼの活性レベルを測定する工程と、
 前記活性レベルを、被験物質を接触させないときの活性レベルと比較する工程とを包含することを特徴とする直鎖状ポリユビキチン化阻害物質のスクリーニング方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • KYOTO UNIVERSITY
  • Inventor
  • IWAI, Kazuhiro
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LT LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PE PG PH PL PT RO RS RU SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG
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