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CONSTRUCTION OF EXPRESSION SYSTEM FOR RNA POLYMERASE DERIVED FROM INFLUENZA VIRUS, CRYSTALLIZATION OF THE RNA POLYMERASE, AND SCREENING METHOD FOR ANTI-INFLUENZA AGENT

Foreign code F110006001
File No. S2008-0612
Posted date Dec 27, 2011
Country WIPO
International application number 2009JP062140
International publication number WO 2010/001967
Date of international filing Jul 2, 2009
Date of international publication Jan 7, 2010
Priority data
  • P2008-173567 (Jul 2, 2008) JP
  • P2009-015497 (Jan 27, 2009) JP
Title CONSTRUCTION OF EXPRESSION SYSTEM FOR RNA POLYMERASE DERIVED FROM INFLUENZA VIRUS, CRYSTALLIZATION OF THE RNA POLYMERASE, AND SCREENING METHOD FOR ANTI-INFLUENZA AGENT
Abstract The object aims to express an RNA polymerase derived from an influenza virus in a large quantity, to crystallize an RNA polymerase derived from an influenza virus, and to provide a method for screening for a substance which can act as an active ingredient for an anti-influenza agent that targets a protein highly conserved among influenza virus species. Disclosed are: a complex which comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence lying between position-239 to position-716 in an RNA polymerase PA subunit and a polypeptide comprising an amino acid sequence lying between position-1 to position-81 in an RNA polymerase PB1 subunit of influenza A/PUERTO RICO/8/1934 H1N1 TYPE; and a method for screening for a substance that can act as an active ingredient for an anti-influenza agent, which comprises the step of selecting a substance capable of inhibiting the interaction between .alpha.-subunit and .beta.-subunit 1 both constituting an influenza virus RNA polymerase in the presence of a candidate substance.
Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】下記の(a1)、(a2)又は(a3)のポリペプチドと、下記の(b1)、(b2)又は(b3)のポリペプチドとを含む複合体。(a1)配列番号6のアミノ酸配列からなるポリペプチド(a2)配列番号6のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド(a3)配列番号5のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド(b1)配列番号8のアミノ酸配列からなるポリペプチド(b2)配列番号8のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(b1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド(b3)配列番号7のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(b1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド

【請求項2】(a1)、(a2)又は(a3)のポリペプチドをコードするDNAと、(b1)、(b2)又は(b3)のポリペプチドをコードするDNAとを含有する組換えベクター。

【請求項3】(a1)、(a2)又は(a3)のポリペプチドをコードするDNAと、(b1)、(b2)又は(b3)のポリペプチドをコードするDNAとを導入した形質転換細胞。

【請求項4】(a1)、(a2)又は(a3)のポリペプチドをコードするDNAと、(b1)、(b2)又は(b3)のポリペプチドをコードするDNAとを導入した形質転換細胞を培養し、培養物から請求項1に記載の複合体を採取することを含む、請求項1に記載の複合体の製造方法。

【請求項5】請求項1に記載の複合体の結晶。

【請求項6】空間群がP3221である請求項5に記載の結晶。

【請求項7】単位格子が、a=b=101.957±50.0Å、c=115.023±50.0Åの大きさを持つ請求項6に記載の結晶。

【請求項8】請求項1に記載の複合体を沈殿剤の存在下に結晶化させることを含む、請求項1に記載の複合体の結晶の製造方法。

【請求項9】沈殿剤が蟻酸ナトリウムである請求項8に記載の方法。

【請求項10】下記の(a1)、(a2)又は(a3)のポリペプチド。(a1)配列番号6のアミノ酸配列からなるポリペプチド(a2)配列番号6のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド(a3)配列番号5のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(a1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド

【請求項11】請求項10に記載のポリペプチドをコードするDNA。

【請求項12】請求項11に記載のDNAを含有する組換えベクター。

【請求項13】請求項10に記載のポリペプチドをコードするDNAを導入した形質転換細胞。

【請求項14】請求項10に記載のポリペプチドをコードするDNAを導入した形質転換細胞を培養し、培養物から請求項10に記載のポリペプチドを採取することを含む、請求項10に記載のポリペプチドの製造方法。

【請求項15】下記の(b1)、(b2)又は(b3)のポリペプチド。(b1)配列番号8のアミノ酸配列からなるポリペプチド(b2)配列番号8のアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ(b1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド(b3)配列番号7のヌクレオチド配列からなるDNAに相補的なDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNAによりコードされるポリペプチドであり、かつ(b1)のポリペプチドと同様の生物学的活性を有するポリペプチド

【請求項16】請求項15に記載のポリペプチドをコードするDNA。

【請求項17】請求項15に記載のDNAを含有する組換えベクター。

【請求項18】請求項15に記載のポリペプチドをコードするDNAを導入した形質転換細胞。

【請求項19】請求項15に記載のポリペプチドをコードするDNAを導入した形質転換細胞を培養し、培養物から請求項15に記載のポリペプチドを採取することを含む、請求項15に記載のポリペプチドの製造方法。

【請求項20】候補物質の存在下で、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼを構成するαサブユニット又はその部分断片とβサブユニット1又はその部分断片とを接触させ、前記αサブユニット又はその部分断片と前記βサブユニット1又はその部分断片との相互作用を阻害する物質を選択する工程を含む、抗インフルエンザ薬の有効成分となり得る物質のスクリーニング方法。

【請求項21】αサブユニットが以下の(a)又は(b)のポリペプチドからなるものである請求項20に記載の方法。(a) 配列番号2で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(b) 配列番号2で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼのαサブユニット活性を有するポリペプチド

【請求項22】αサブユニットの部分断片が、以下の(a)又は(b)のポリペプチドからなるものである請求項20に記載の方法。(a) 配列番号2で表されるアミノ酸配列のC末端から130残基以内のアミノ酸配列からなるポリペプチド(b) 配列番号2で表されるアミノ酸配列のC末端から130残基以内のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼのαサブユニット活性を有するポリペプチド

【請求項23】βサブユニット1が以下の(a)又は(b)のポリペプチドからなるものである請求項20に記載の方法。(a) 配列番号4で表されるアミノ酸配列からなるポリペプチド(b) 配列番号4で表されるアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼのβサブユニット1活性を有するポリペプチド

【請求項24】βサブユニット1の部分断片が、以下の(a)又は(b)のポリペプチドからなるものである請求項20に記載の方法。(a) 配列番号4で表されるアミノ酸配列のN末端から15残基以内のアミノ酸配列からなるポリペプチド(b) 配列番号4で表されるアミノ酸配列のN末端から15残基以内のアミノ酸配列において1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、インフルエンザウイルスのRNAポリメラーゼのβサブユニット1活性を有するポリペプチド

【請求項25】αサブユニットの相互作用部位のアミノ酸残基が、配列番号2で表されるアミノ酸配列におけるGln408、Phe411、Asn412、Met595、Glu617、Thr618、Trp619、Pro620、Ile621、Glu623、Val636、Leu640、Leu666、Leu667、Gln670、Arg673、Trp706及びPhe710からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基である請求項20~24のいずれか1項に記載の方法。

【請求項26】βサブユニット1の相互作用部位のアミノ酸残基が、配列番号4で表されるアミノ酸配列におけるMet1、Asp2、Val3、Asn4、Pro5、Thr6、Leu7、Leu8、Phe9、Leu10、Lys11、Val12、Pro13及びAla14からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基である、請求項20~24のいずれか1項に記載の方法。

【請求項27】αサブユニットの相互作用部位のアミノ酸残基が、配列番号2で表されるアミノ酸配列におけるVal636、Leu640、Leu666及びTrp706からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基である請求項25に記載の方法。

【請求項28】βサブユニット1の相互作用部位のアミノ酸残基が、配列番号4で表されるアミノ酸配列におけるAsn4、Pro5、Thr6、Leu7、Leu8、Phe9及びLeu10からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸残基である、請求項26に記載の方法。

【請求項29】βサブユニット1の相互作用部位のアミノ酸残基が、配列番号4で表されるアミノ酸配列の5~10番目のアミノ酸残基である請求項26に記載の方法。

【請求項30】候補物質が、化合物及びその塩、ペプチド、抗体並びに核酸からなる群から選択される少なくとも一種である、請求項20~29のいずれか1項に記載の方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • UNIVERSITY OF TSUKUBA
  • PUBLIC UNIVERSITY CORPORATION YOKOHAMA CITY UNIVERSITY
  • Inventor
  • NAGATA Kyosuke
  • KAWAGUCHI Atsushi
  • PARK Sam-Yong
  • OBAYASHI Eiji
IPC(International Patent Classification)
Specified countries AE(UTILITY MODEL),AG,AL(UTILITY MODEL),AM(PROVISIONAL PATENT)(UTILITY MODEL),AO(UTILITY MODEL),AT(UTILITY MODEL),AU,AZ(UTILITY MODEL),BA,BB,BG(UTILITY MODEL),BH(UTILITY MODEL),BR(UTILITY MODEL),BW(UTILITY MODEL),BY(UTILITY MODEL),BZ(UTILITY MODEL),CA,CH,CL(UTILITY MODEL),CN(UTILITY MODEL),CO(UTILITY MODEL),CR(UTILITY MODEL),CU(INVENTOR'S CERTIFICATE),CZ(UTILITY MODEL),DE(UTILITY MODEL),DK(UTILITY MODEL),DM,DO(UTILITY MODEL),DZ,EC(UTILITY MODEL),EE(UTILITY MODEL),EG(UTILITY MODEL),ES(UTILITY MODEL),FI(UTILITY MODEL),GB,GD,GE(UTILITY MODEL),GH(UTILITY CERTIFICATE),GM,GT(UTILITY MODEL),HN,HR(CONSENSUAL PATENT),HU(UTILITY MODEL),ID,IL,IN,IS,JP(UTILITY MODEL),KE(UTILITY MODEL),KG(UTILITY MODEL),KM,KN,KP(INVENTOR'S CERTIFICATE)(UTILITY MODEL),KR(UTILITY MODEL),KZ(PROVISIONAL PATENT)(UTILITY MODEL),LA,LC,LK,LR,LS(UTILITY MODEL),LT,LU,LY,MA,MD(UTILITY MODEL),ME,MG,MK,MN,MW,MX(UTILITY MODEL),MY(UTILITY-INNOVATION),MZ(UTILITY MODEL),NA,NG,NI(UTILITY MODEL),NO,NZ,OM(UTILITY MODEL),PE(UTILITY MODEL),PG,PH(UTILITY MODEL),PL(UTILITY MODEL),PT(UTILITY MODEL),RO,RS(PETTY PATENT),RU(UTILITY MODEL),SC,SD,SE,SG,SK(UTILITY MODEL),SL(UTILITY MODEL),SM,ST,SV(UTILITY MODEL),SY,TJ(UTILITY MODEL),TM(PROVISIONAL PATENT),TN,TR(UTILITY MODEL),TT(UTILITY CERTIFICATE),TZ,UA(UTILITY MODEL),UG(UTILITY CERTIFICATE),US,UZ(UTILITY MODEL),VC(UTILITY CERTIFICATE),VN(PATENT FOR UTILITY SOLUTION),ZA,ZM,ZW,EP(AT,BE,BG,CH,CY,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,FR,GB,GR,HR,HU,IE,IS,IT,LT,LU,LV,MC,MK,MT,NL,NO,PL,PT,RO,SE,SI,SK,SM,TR),OA(BF(UTILITY MODEL),BJ(UTILITY MODEL),CF(UTILITY MODEL),CG(UTILITY MODEL),CI(UTILITY MODEL),CM(UTILITY MODEL),GA(UTILITY MODEL),GN(UTILITY MODEL),GQ(UTILITY MODEL),GW(UTILITY MODEL),ML(UTILITY MODEL),MR(UTILITY MODEL),NE(UTILITY MODEL),SN(UTILITY MODEL),TD(UTILITY MODEL),TG(UTILITY MODEL)),AP(BW(UTILITY MODEL),GH(UTILITY MODEL),GM(UTILITY MODEL),KE(UTILITY MODEL),LS(UTILITY MODEL),MW(UTILITY MODEL),MZ(UTILITY MODEL),NA(UTILITY MODEL),SD(UTILITY MODEL),SL(UTILITY MODEL),SZ(UTILITY MODEL),TZ(UTILITY MODEL),UG(UTILITY MODEL),ZM(UTILITY MODEL),ZW(UTILITY MODEL)),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,TJ,TM)
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