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VARIANT REVERSE TRANSCRIPTASE

Foreign code F120006607
File No. 2953,S2010-1069
Posted date May 16, 2012
Country WIPO
International application number 2011JP068157
International publication number WO 2012020759
Date of international filing Aug 9, 2011
Date of international publication Feb 16, 2012
Priority data
  • P2010-181471 (Aug 13, 2010) JP
Title VARIANT REVERSE TRANSCRIPTASE
Abstract Provided are: a variant reverse transcriptase which has a high heat stability and a high versatility; a nucleic acid thereof; a method for producing the variant reverse transcriptase; a highly versatile reverse transcription kit; a highly versatile detection kit; a method for improving the heat stability of a nucleic acid enzyme whereby the heat stability of the nucleic acid enzyme can be highly improved; and a reverse transcription method whereby reverse transcription can be efficiently conducted. An amino acid residue in a nucleic acid interaction domain of a wild type enzyme is substituted by a positively charged amino acid residue or a nonpolar amino acid residue to form a nucleic acid interaction domain having a larger positive net charge than the nucleic acid interaction domain of the wild type enzyme.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Reverse transcriptase, in general, active RNA as a template to synthesize cDNA (hereinafter, 'RNA-dependent DNA polymerase activity' that) and, as a template to synthesize DNA DNA activity (hereinafter, 'DNA-dependent DNA polymerase activity' that) and, RNA: the decomposition of chain RNA in the hybrid DNA (hereinafter, 'RNase H activity' that) has.
A reverse transcriptase, RNA-dependent DNA polymerase activity wherein it has, for example, the amino acid sequence of an expressed protein is a living body directly reflects the analyzing the base sequence of mRNA, cDNA library construction, for applications such as RT-PCR is used. In such applications, conventional, Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase or avian myeloblastosis virus reverse transcriptase is used.
In addition, it is easy to form the secondary mRNA structure has a base sequence, the synthesis of cDNA by a reverse transcriptase impeded by the secondary structure from, an elevated reaction temperature of forming a secondary structure by combining while suppressing cDNA is desired. However, the Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase and avian myeloblastosis virus reverse transcriptase wild-type reverse transcriptase, a relatively low thermal stability, inhibits the formation of the secondary structure of RNA such as temperature, sometimes inactivated. Therefore, improvement of heat resistance with the reverse transcriptase has been proposed (for example, Patent Document 1 and see non-patent document 1).
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲 [請求項1]
 野生型逆転写酵素のDNA相互作用領域中のアミノ酸残基の正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基への置換を有しており、前記野生型逆転写酵素のDNA相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有するDNA相互作用領域を有しており、かつ逆転写酵素活性を示すことを特徴とする、変異型逆転写酵素。

[請求項2]
 前記野生型逆転写酵素が、配列番号:2に対応するアミノ酸配列からなり、
 前記野生型逆転写酵素のDNA相互作用領域中のアミノ酸残基が、配列番号:2の24位のスレオニン残基~474位のプロリン残基に対応する領域中に局在するアミノ酸残基である、請求項1に記載の変異型逆転写酵素。

[請求項3]
 配列番号:2に対応するアミノ酸配列において、配列番号:2の24位のスレオニン残基~474位のプロリン残基に対応する領域中にアミノ酸残基の保存的置換を有する、請求項2に記載の変異型逆転写酵素。

[請求項4]
 (A)配列番号:2に対応するアミノ酸配列において、配列番号:2の24位のスレオニン残基~474位のプロリン残基に対応する領域を除く配列における1または数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入または付加をさらに有するアミノ酸配列、および
(B)配列番号:2の24位のスレオニン残基~474位のプロリン残基に対応する領域を除く配列に対して、BLASTアルゴリズムにより、Gap Costs(Existence 11、Extension 1)、Expect 10、Word Size 3の条件でアラインメントして得られた配列同一性が少なくとも80%であるアミノ酸配列
のいずれかのアミノ酸配列を有しており、かつ逆転写酵素活性を示す、請求項2または3に記載の変異型逆転写酵素。

[請求項5]
 配列番号:2の24位のスレオニン残基~474位のプロリン残基に対応する領域に局在するアミノ酸残基のうちの負電荷アミノ酸残基の少なくともいずれかが、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されている、請求項2~4のいずれかに記載の変異型逆転写酵素。

[請求項6]
 配列番号:2に対応するアミノ酸配列において、配列番号:2の少なくとも286位のグルタミン酸残基に対応するアミノ酸残基が、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており、かつ逆転写酵素活性を示すことを特徴とする、変異型逆転写酵素。

[請求項7]
 配列番号:2に対応するアミノ酸配列において、配列番号:2中のアミノ酸残基:
69位のグルタミン酸残基、108位のアスパラギン酸残基、117位のグルタミン酸残基、124位のアスパラギン酸残基、286位のグルタミン酸残基、302位のグルタミン酸残基、313位のトリプトファン残基、435位のロイシン残基および454位のアスパラギン残基
の少なくとも1つに対応する残基が、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換されており(ただし、302位のグルタミン酸残基のアルギニンへの置換を除く)、かつ逆転写酵素活性を示すことを特徴とする、変異型逆転写酵素。

[請求項8]
 配列番号:2に対応するアミノ酸配列において、下記アミノ酸残基の置換(a)~(i):
(a)配列番号:2の286位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
(b)配列番号:2の302位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはリジン残基への置換、
(c)配列番号:2の435位のロイシン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
(d)配列番号:2の124位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
(e)配列番号:2の69位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはアルギニン残基への置換、
(f)配列番号:2の108位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、
(g)配列番号:2の117位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基またはリジン残基への置換、
(h)配列番号:2の313位のトリプトファン残基に対応する残基のアラニン残基、リジン残基またはアルギニン残基への置換、および
(i)配列番号:2の454位のアスパラギン残基に対応する残基のアラニン残基またはアルギニン残基への置換
からなる群より選択された少なくとも1つを有するアミノ酸配列からなり、かつ逆転写酵素活性を示すことを特徴とする、変異型逆転写酵素。

[請求項9]
 (I)配列番号:2に対応するアミノ酸配列において、下記アミノ酸残基の置換(a-1)~(c-1):
(a-1)配列番号:2の286位のグルタミン酸残基に対応する残基のアラニン残基への置換、
(b-1)配列番号:2の302位のグルタミン酸残基に対応する残基のリジン残基への置換、および
(c-1)配列番号:2の435位のロイシン残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
を有するアミノ酸配列、または
(II)前記(I)のアミノ酸配列において、(d-1)配列番号:2の124位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアルギニン残基への置換
をさらに有するアミノ酸配列
からなり、かつ逆転写酵素活性を示す、請求項8に記載の変異型逆転写酵素。

[請求項10]
 前記(I)または(II)のアミノ酸配列において、
(e-1)配列番号:2の524位のアスパラギン酸残基に対応する残基のアラニン残基への置換
をさらに有するアミノ酸配列
からなり、かつ逆転写酵素活性を示す、請求項9に記載の変異型逆転写酵素。

[請求項11]
 請求項1~10のいずれかに記載の変異型逆転写酵素をコードする核酸。

[請求項12]
 請求項1~10のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を製造する方法であって、
 請求項11に記載の核酸を保持する細胞を培養して当該核酸にコードされた変異型逆転写酵素を発現させ、培養物を得る工程、および
 前記工程で得られた培養物から変異型逆転写酵素を回収する工程
を含む、変異型逆転写酵素の製造方法。

[請求項13]
 請求項1~10のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を用いてRNAからcDNAを合成することを特徴とする逆転写方法。

[請求項14]
 逆転写反応を行なうためのキットであって、
 請求項1~10のいずれかに記載の変異型逆転写酵素を含有することを特徴とする逆転写反応キット。

[請求項15]
 生体から得られたRNAを含む試料中のマーカーを検出するためのキットであって、
 請求項1~10のいずれかに記載の変異型逆転写酵素と前記マーカーの検出用試薬とを含有することを特徴とする検出キット。

[請求項16]
 核酸と相互作用する核酸相互作用領域を有する核酸関連酵素の熱安定性を向上させる方法であって、
 野生型核酸関連酵素をコードする核酸中の前記核酸相互作用領域に対応する塩基配列に対して、前記核酸相互作用領域中のアミノ酸残基を、正電荷アミノ酸残基または非極性アミノ酸残基に置換させる変異を導入して、前記野生型核酸関連酵素の核酸相互作用領域よりも大きい正の実効電荷を有する核酸相互作用領域を形成させることを特徴とする、核酸関連酵素の熱安定性の向上方法。

[請求項17]
 前記核酸関連酵素が逆転写酵素である、請求項16に記載の方法。

  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • Kyoto University
  • Inventor
  • YASUKAWA, Kiyoshi
  • INOUYE, Kuniyo
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LT LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PE PG PH PL PT QA RO RS RU SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG
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