Top > Search of International Patents > LINKER FOR UNIMOLECULAR FRET BIOSENSOR BASED ON PRINCIPLE OF FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER

LINKER FOR UNIMOLECULAR FRET BIOSENSOR BASED ON PRINCIPLE OF FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER

Foreign code F120006680
Posted date May 24, 2012
Country WIPO
International application number 2011JP071891
International publication number WO 2012043477
Date of international filing Sep 26, 2011
Date of international publication Apr 5, 2012
Priority data
  • P2010-215738 (Sep 27, 2010) JP
Title LINKER FOR UNIMOLECULAR FRET BIOSENSOR BASED ON PRINCIPLE OF FLUORESCENCE RESONANCE ENERGY TRANSFER
Abstract [Problem] To provide a linker for a unimolecular FRET biosensor, as well as a unimolecular FRET biosensor and such generally containing a linker, which enable the measurement of non-invasive serine-threonine protein kinase activity, tyrosine kinase activity, and small GTP-binding protein activity, and are based on the principle of fluorescence resonance energy transfer.
[Solution] Provided is: a linker that is a polypeptide containing between 52 and 400 amino acid residues, with at least 95% of the total number of amino acid residues comprising glycine, serine, threonine, and alanine, and which contains 35-65% of glycine, 10-40% of serine and/or threonine, and 10-40% of alanine; unimolecular FRET biosensors mostly containing linkers; a transformed cell which holds an expression vector containing a gene which codes the biosensors; and a transgenic nonhuman animal.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Fluorescence resonance energy transfer (Fluorescence resonance energy transfer, hereinafter sometimes referred to as FRET) fluorescent protein utilizing the principle of the biosensor in the field of life science has spread rapidly (for example see non-patent document 1-4).
Is FRET, a fluorescent molecule in an excited state (donor: energy donor) from the immediate vicinity of the fluorescent molecule (acceptor: energy acceptor) phenomenon to be a transferring excitation energy. Using FRET for the dissemination of the biosensor, color mutants of green fluorescent protein (GFP) appearance and greatly contributes to the improvement thereof. Currently, in many cases, GFP CFP (cyan fluorescent protein) is a mutant of YFP (yellow fluorescent protein) and the donor and the acceptor and used as a fluorescent protein.
Fluorescent protein biosensor system using FRET, two types of molecules (Fig. 1) and biosensor FRET FRET (Fig. 2) single-molecule-roughly divided into the biosensor. A second molecule type FRET biosensor and detecting interactions between molecules, single-molecule-FRET biosensor detects a change in the structure of the molecule (for example see non-patent document 1-4).
Among them, two-molecule-1 (single-molecule-FRET biosensor) biosensor is, ion, sugar, and quantitative analysis of low molecules such as lipids, low molecular weight GTP binding protein, phosphorylation is used to measure such as an enzyme activity has been developed (for example see non-patent document 4). However, in order to produce this biosensor is, at least one 3, 4 in many cases needs to be bonded to one or more protein domains and, simply combining them is usually only, have sufficient sensitivity to single-molecule-FRET biosensor cannot be created. That is, such a single-molecule-FRET biosensor creation, i) and the light emission spectrum of the donor fluorescent protein and the overlap of the absorption spectrum of the acceptor fluorescent protein, ii) the distance between the donor fluorescent protein and the acceptor fluorescent protein, iii) the donor fluorescent protein acceptor emission and the moment of the orientation of the fluorescent protein 3 absorbing moment must be factors are taken into consideration. In addition, a fluorescent protein when fuzed with other proteins, other proteins fuzed with a fluorescent protein misfolding of stress occurs and, as a result, can reduce the efficiency of chromophore formation, the possibility that the non-fluorescence must be also taken into account. In this way, the donor fluorescent protein and the acceptor fluorescent protein using FRET between them to create the successful expression of the stringent condition is present, the arrangement of the between the two does not have also been found in a certain rule, create a single-molecule-FRET for each biosensor, the length of the query protein domains respectively, various changes in the inter-domain linker sequences and the like, to create optimal are performed, this includes, such as a lot of trial and requires complicated and advanced experiments, single-molecule-having sensitivity sufficient for the development of biosensor FRET Breeden and was accompanied by.
Connecting each of the domains linkers include, 9 of the amino acids glycine, serine, threonine or particles (for example see non-patent document 5), 72 amino acid glycine linker (for example see non-patent document 6) are reported, and is sufficiently optimized cannot. In addition, these linkers in, many types of single-molecule-FRET biosensor can be optimized in common were not.
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲 [請求項1]
 蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型FRETバイオセンサーのリンカーであって、52アミノ酸残基以上400アミノ酸残基以下を含むポリペプチドであって、全アミノ酸残基数の少なくとも45%がグリシン及びアラニンの少なくともいずれかであり、アラニンを全アミノ酸残基数の少なくとも10%含むことを特徴とするリンカー。

[請求項2]
 84アミノ酸残基以上を含むポリペプチドである請求項1に記載のリンカー。

[請求項3]
 セリン及びスレオニンの少なくともいずれかを全アミノ酸残基数の少なくとも10%含む請求項1又は2に記載のリンカー。

[請求項4]
 全アミノ酸残基数の少なくとも95%がグリシン、セリン、スレオニン及びアラニンからなり、グリシンを35から65%、セリン及びスレオニンの少なくともいずれかを10から40%、アラニンを10から40%含む請求項3に記載のリンカー。

[請求項5]
 全アミノ酸配列の少なくとも95%がSAGG及びGGASのいずれかのアミノ酸配列の繰り返しからなり、SAGG及びGGASのいずれかのアミノ酸配列の繰り返し単位を13個以上100個以下含むことを特徴とする請求項4に記載のリンカー。

[請求項6]
 アルギニン及びグルタミン酸の少なくともいずれかを全アミノ酸残基数の少なくとも10%含む請求項1又は2に記載のリンカー。

[請求項7]
 全アミノ酸残基数の少なくとも95%がグリシン、アルギニン、グルタミン酸及びアラニンからなり、グリシンを4から30%、アルギニンを5から30%、グルタミン酸を5から30%、及びアラニンを30から60%含む請求項6に記載のリンカー。

[請求項8]
 請求項1から7のいずれかに記載のリンカーをコードすることを特徴とする遺伝子。

[請求項9]
 請求項1から7のいずれかに記載のリンカーをコードする遺伝子を含むことを特徴とする発現ベクター。

[請求項10]
 請求項9に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とする形質転換された細胞。

[請求項11]
 請求項9に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物。

[請求項12]
 蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型FRETバイオセンサーであって、センサー領域、リガンド領域、アクセプター蛍光タンパク質領域、ドナー蛍光タンパク質領域、及び、該センサー領域と該リガンド領域とを連結するリンカー領域を有する融合タンパク質であり、該リンカー領域が、請求項1から7のいずれかに記載のリンカーからなることを特徴とする一分子型FRETバイオセンサー。

[請求項13]
 該ドナー蛍光タンパク質がYPetである請求項12に記載の一分子型FRETバイオセンサー。

[請求項14]
 請求項12及び13のいずれかに記載の一分子型FRETバイオセンサーをコードすることを特徴とする遺伝子。

[請求項15]
 請求項14に記載の一分子型FRETバイオセンサーをコードする遺伝子を含むことを特徴とする発現ベクター。

[請求項16]
 請求項15に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とする形質転換された細胞。

[請求項17]
 請求項15に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物。

[請求項18]
 請求項12に記載の一分子型FRETバイオセンサーを用いてFRETを検出する工程を含み、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかを測定することを特徴とする測定方法。

[請求項19]
 請求項16に記載の形質転換された細胞または請求項17に記載のトランスジェニック非ヒト動物を用いてFRETを検出する工程を含み、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかを測定することを特徴とする測定方法。

[請求項20]
 (a)請求項16に記載の形質転換された細胞と被検物質とを接触させる工程、および
(b)FRETを検出することによりセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかの変化を検出する工程、
を含む、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかの調節物質のスクリーニング方法。

  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • Kyoto University
  • Inventor
  • MATSUDA, Michiyuki
  • KOMATSU, Naoki
  • AOKI, Kazuhiro
  • KAMIOKA, Yuuji
  • YUKINAGA, Hiroko
  • INAOKA, Yoshie
  • SAKURAI, Aturou
  • KIYOKAWA, Etuko
  • SUMIYAMA, Kenta
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LT LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG
Please contact us by e-mail or facsimile if you have any interests on this patent. Thanks.

PAGE TOP

close
close
close
close
close
close