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VECTOR FOR FOREIGN GENE INTRODUCTION AND METHOD FOR PRODUCING VECTOR TO WHICH FOREIGN GENE HAS BEEN INTRODUCED

Foreign code F130007256
File No. H22-S17
Posted date Apr 2, 2013
Country WIPO
International application number 2012JP057875
International publication number WO 2012133376
Date of international filing Mar 27, 2012
Date of international publication Oct 4, 2012
Priority data
  • P2011-075273 (Mar 30, 2011) JP
Title VECTOR FOR FOREIGN GENE INTRODUCTION AND METHOD FOR PRODUCING VECTOR TO WHICH FOREIGN GENE HAS BEEN INTRODUCED
Abstract The purpose of the invention is to provide means with which it is possible to efficiently select a vector to which a foreign gene has been introduced when a foreign gene is to be introduced by homologous recombination to a vector having multiple sequences homologous with one another. The vector comprises, in succession, a replication origin, a sequence A, a marker gene X, two sequences C and D for introducing a foreign gene by homologous recombination, and a sequence B homologous with sequence A. The two sequences C and D are directly or indirectly adjacent to one another. The vector is used for the introduction of a foreign gene between the two adjacent sequences C and D.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Conventional, for introduction of the gene of interest in the vector, usually, the restriction enzyme is used. Specifically, the vector multiple cloning, site specific cleavage with a restriction enzyme, the cleavage site, a restriction enzyme site corresponding to the gene of interest has a restriction site was introduced into a nucleic acid fragment. In recent years, each of the two present in the vector sequence and two sequences homologous to a nucleic acid fragment comprising a gene of interest disposed at both ends is prepared, and the two sequences in the vector between the sequence of the nucleic acid fragments in the two homologous recombination can be carried out, a gene of interest has been developed a method and introduced into a vector, is being used (Zhang Y, Muyrers J.P.P., Testa G and Stewart A.F. DNA cloning by homologous recombination in E.Coli. Nature Biotechnology 18:1314-1317, 2000, and Quinn Lu, Seamless cloning and gene fusion. TRENDS in Biotechnology 23:199-207, 2005).
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲 [請求項1]
 複製起点、配列A、マーカー遺伝子X、相同組換えにより外来遺伝子を導入するための二つの配列C及びD、並びに前記配列Aと相同な配列Bをこの順に含むベクターであって、前記二つの配列C及びDは、直接または間接的に隣接し、前記隣接する二つの配列C及びDの間に外来遺伝子を導入するために用いられるためのベクター。

[請求項2]
 ベクターがレトロウイルスベクターである、請求項1に記載のベクター。

[請求項3]
 ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項1又は2に記載のベクター。

[請求項4]
 前記配列Aがレトロウイルスのゲノムに含まれる3’LTRであり、かつ前記配列Bがレトロウイルスのゲノムに含まれる5’LTRである、請求項1~3のいずれか1項に記載のベクター。

[請求項5]
 前記配列Aがレトロウイルスのゲノムに含まれる5’LTRであり、かつ前記配列Bがレトロウイルスのゲノムに含まれる3’LTRである、請求項1~3のいずれか1項に記載のベクター。

[請求項6]
 マーカー遺伝子Xが、蛍光タンパク質遺伝子又は薬剤耐性遺伝子である、請求項1~5のいずれか1項に記載のベクター。

[請求項7]
 マーカー遺伝子Xが、ルシフェラーゼ又はβ‐ガラクトシダーゼをコードする遺伝子である、請求項1~5のいずれか1項に記載のベクター。

[請求項8]
 複製起点及び配列Aは間接的に隣接し、かつ前記隣接する複製起点及び配列Aの間に、マーカー遺伝子Xとは異なるマーカー遺伝子Yをさらに含む、請求項1~7のいずれか1項に記載のベクター。

[請求項9]
 複製起点及び配列Bは間接的に隣接し、かつ前記隣接する複製起点及び配列Bの間に、マーカー遺伝子Xとは異なるマーカー遺伝子Yをさらに含む、請求項1~7のいずれか1項に記載のベクター。

[請求項10]
 マーカー遺伝子Yが、蛍光タンパク質遺伝子又は薬剤耐性遺伝子である、請求項8又は9に記載のベクター。

[請求項11]
 マーカー遺伝子Yが、ルシフェラーゼ又はβ‐ガラクトシダーゼをコードする遺伝子である、請求項8又は9に記載のベクター。

[請求項12]
 複製起点が、大腸菌( Escherichia coli)、バクテリオファージ、 Saccharomyces cerevisiae、及び Schizosaccharomyces pombeから選択される生物の複製起点である、請求項1~11のいずれか1項に記載のベクター。

[請求項13]
 請求項1~12のいずれか1項に記載のベクターにおいて前記隣接する配列C及びDの間に外来遺伝子が導入されたベクターを製造する方法であって、以下の工程を含む方法:
 請求項1~12のいずれか1項に記載のベクターを準備する工程(1)、
 前記配列Cと相同な配列C’、外来遺伝子、及び前記配列Dと相同な配列D’をこの順に含む核酸断片を準備する工程(2)、
 前記ベクターと前記核酸断片とを相同組換えを起こす条件下に置くことによる前記隣接する配列C及びDの間に外来遺伝子が導入されたベクターの生成、及び前記隣接する配列C及びDの間に外来遺伝子が導入されたベクターを有する宿主の形成を行う工程(3)、
 工程(3)で得られた宿主を培養し、培養物中からマーカー遺伝子Xの発現を指標として、配列C及びDの間に外来遺伝子が導入されたベクターを有する宿主を選抜する工程(4)、及び
 工程(4)において選抜した宿主から配列C及びDの間に外来遺伝子が導入されたベクターを抽出する工程(5)。

[請求項14]
 前記工程(3)は、相同組換えを起こす酵素と、前記ベクター及び前記核酸断片とを混合して相同組換え産物を得、得られた産物を宿主に形質転換することにより実施される、請求項13に記載の方法。

[請求項15]
 前記工程(3)は、相同組換えを起こす酵素をコードする遺伝子及び前記ベクターと前記核酸断片とを含む宿主を得、得られた宿主において前記相同組換えを起こす酵素をコードする遺伝子を発現させることにより実施される、請求項13に記載の方法。

  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION UNIVERSITY OF TOYAMA
  • Inventor
  • HORII, Masae
  • KISHI, Hiroyuki
  • KOBAYASHI, Eiji
  • OZAWA, Tatsuhiko
  • MURAGUCHI, Atsushi
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LT LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG
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