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MUTANT PYRROLYSYL-TRNA SYNTHETASE, AND METHOD FOR PRODUCTION OF PROTEIN HAVING NON-NATURAL AMINO ACID INTEGRATED THEREIN BY USING THE SAME achieved

Foreign code F130007279
File No. 23000
Posted date Apr 8, 2013
Country WIPO
International application number 2008JP067029
International publication number WO 2009038195
Date of international filing Sep 19, 2008
Date of international publication Mar 26, 2009
Priority data
  • P2007-243574 (Sep 20, 2007) JP
Title MUTANT PYRROLYSYL-TRNA SYNTHETASE, AND METHOD FOR PRODUCTION OF PROTEIN HAVING NON-NATURAL AMINO ACID INTEGRATED THEREIN BY USING THE SAME achieved
Abstract Disclosed is a method for introducing a lysine derivative (particularly an N&egr;-benzyloxycarbonyl-lysine (Z-Lys) derivative) having a useful functional group such as a heavy atom, selenium, a reactive functional group, a fluorescent group or a crosslinker, which is suitable as a non-natural amino acid, into a desired protein in a site-specific manner. Also disclosed is a mutant pyrrolysyl-tRNA shnthetase which has the substitution of at least one amino acid residue selected from a tyrosine residue at position-306, a leucine residue at position-309 and a cysteine residue at position-348 each constituting a pyrrolidin-binding site in the amino acid sequence for pyrrolysyl-tRNA shnthetase depicted in SEQ ID NO:2, wherein the substitution of the amino acid residue is the substitution of a tyrosine residue at position-306 by a glycine or alanine residue, the substitution of a leucine residue at position-309 by a glycine or alanine residue, or the substitution of a cysteine residue at position-348 by a valine, serine or alanine residue.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
At a desired position in the protein amino acid residues, of protein synthesis associated with normal (non-natural amino acid) other than the type 20 is substituted with an amino acid, non-natural amino acid is incorporated in the protein (allo-protein), the structure of the proteins, for functional analysis of proteins can be an effective means. Aminoacyl - tRNA synthetase various from a species of organism using the pair (aaRS) /tRNA, one or more 30 allo already synthesized protein. Many useful and most and has long been applied to the non-natural amino acid is introduced into the system, - tRNA synthetase (TyrRS) variants which tRNATyr and pair. This method is, eubacteria, archaebacteria and eukaryotic aaRS and is one of the groups 2, aminoacylated tRNA in each group but is, of the other groups cannot be aminoacylated tRNA (orthogonal) orthogonality of the key and the relationship to each other. For example, archaeal , of (Methanocaldococcus jannaschii) TyrRS/tRNATyr pair E. coli system, on the other hand E. coli TyrRS Bacillus, stearothermophilus tRNATyr mammalian cells in a system of the pair of orthogonal pair for, in these lines can be used in dilatation of the genetic code (for example, see patent document 1 and non-patent document 1).
On the other hand, , (Methanosarcina mazei) - tRNA synthetase (PylRS) derived from pyrrolidyl and tRNAPyl is, aaRS/tRNA pair in E. coli cells function as has the orthogonal properties (for example, see non-patent document 2). Further, the pair, in eukaryotic cells can be used in the genetic code expansion is reported (for example, see Patent Document 2). Pyrrolidine sterically bulky side chain (Pyrrolysine) having a lysine derivative. Wild-type PylRS is, in E. coli Nε -Boc-L-lysine tRNAPyl may be bonded to a (see Patent Document 2). In addition, and wild-type PylRS, ATP analog, pyrrolidine, or of a complex between X ray crystal structure have been reported (non-patent document 3, see 4 and 9).
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲 [1]
 配列番号2に示したピロリジル-tRNA合成酵素のアミノ酸配列においてピロリジン結合部位を構成する306位のチロシン、309位のロイシン、及び348位のシステインから選択される少なくとも1つのアミノ酸残基が置換された変異体酵素であって、当該アミノ酸置換が、
 306位のチロシンからグリシン又はアラニンへ、
 309位のロイシンからグリシン又はアラニンへ、及び
 348位のシステインからバリン、セリン又はアラニンへ、
 の置換である変異体ピロリジル-tRNA合成酵素。

[2]
 さらに384位のチロシンからフェニルアラニン若しくはヒスチジンへのアミノ酸置換を含む請求項1に記載の変異体ピロリジル-tRNA合成酵素。

[3]
 前記アミノ酸置換が、306位のチロシンからアラニンへ、及び384位のチロシンからフェニルアラニンへの二重置換を含む請求項2に記載の変異体ピロリジル-tRNA合成酵素。

[4]
 前記アミノ酸置換が、309位のロイシンからアラニンへ、及び384位のチロシンからフェニルアラニンへの二重置換を含む請求項2に記載の変異体ピロリジル-tRNA合成酵素。

[5]
 前記アミノ酸置換が、309位のロイシンからアラニンへ、348位のシステインからバリンへ、及び384位のチロシンからフェニルアラニンへの三重置換を含む請求項2に記載の変異体ピロリジル-tRNA合成酵素。

[6]
 請求項1~5何れか記載の変異体ピロリジル-tRNA合成酵素において、306位、309位、348位及び384位以外の1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつN ε-ベンジルオキシカルボニル-リジンをアミノアシル化しうることを特徴とする変異体ピロリジル-tRNA合成酵素。

[7]
 野生型ピロリジル-tRNA合成酵素が、配列番号2に示したアミノ酸配列の相同体であるメタノサルシナ属由来のピロリジル-tRNA合成酵素において、前記相同体のアミノ酸配列と配列番号2に示したアミノ酸配列とをアライメントしたとき、配列番号2に示したアミノ酸配列の306位に対応するチロシンがアラニンに置換され、及び/又は384位に対応するチロシンがフェニルアラニンに置換されてなる変異体ピロリジル-tRNA合成酵素。

[8]
 請求項1~7何れか記載の変異体ピロリジル-tRNA合成酵素をコードする単離されたDNA。

[9]
 宿主細胞に導入したときに、当該宿主細胞内で請求項1~7何れか記載の変異体ピロリジル-tRNA合成酵素を産生し得る発現ベクターであって、該発現ベクターは、前記宿主細胞内における発現制御配列に機能的に結合された、請求項8に記載のDNAを含む発現ベクター。

[10]
 請求項9に記載の発現ベクターによって形質転換されたことを特徴とする真正細菌。

[11]
 請求項9に記載の発現ベクターによって形質転換されたことを特徴とする大腸菌。

[12]
 請求項9に記載の発現ベクターによって形質転換されたことを特徴とする哺乳動物培養細胞。

[13]
(a)N ε-ベンジルオキシカルボニル-リジン誘導体を活性化しうるアミノアシルtRNA合成酵素と、
(b)前記アミノアシルtRNA合成酵素の存在下でN ε-ベンジルオキシカルボニル-リジン誘導体と結合可能なサプレッサーtRNAと、
(c)所望の位置にナンセンス変異又はフレームシフト変異を受けた所望のタンパク質をコードする遺伝子と、
 を前記N ε-ベンジルオキシカルボニル-リジン誘導体の存在下に細胞内又は細胞抽出液内で発現させることを特徴とする非天然アミノ酸組み込みタンパク質の製造方法。

[14]
 前記アミノアシルtRNA合成酵素が、請求項1~5何れか記載の変異体ピロリジル-tRNA合成酵素である請求項13に記載の方法。

[15]
 前記N ε-ベンジルオキシカルボニル-リジン誘導体が、N ε-オルト-ヨード-ベンジルオキシカルボニル-リジン、ベンジルオキシカルボニル-アミノエチル-セレノシステイン、N ε-オルト-エチニル-ベンジルオキシカルボニル-リジン、N ε-オルト-アジド-ベンジルオキシカルボニル-リジン、又はN ε-オルト-ジアジリル-ベンジルオキシカルボニル-リジンである請求項13又は14に記載の方法。

[16]
(a)細胞抽出液と、
(b)N ε-ベンジルオキシカルボニル-リジン誘導体からなる非天然アミノ酸と、
(c)請求項1~7何れか記載の変異体ピロリジル-tRNA合成酵素と、
(d)前記変異体ピロリジル-tRNA合成酵素の存在下でN ε-ベンジルオキシカルボニル-リジン誘導体と結合可能なサプレッサーtRNAと、を含む非天然アミノ酸組み込みタンパク質合成キット。

  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • RIKEN
  • Inventor
  • YOKOYAMA, Shigeyuki
  • SAKAMOTO, Kensaku
  • YANAGISAWA, Tatsuo
  • KOBAYASHI, Takatsugu
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BR BW BY BZ CA CH CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LT LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PG PH PL PT RO RS RU SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LS MW MZ NA SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM
EPO: AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG

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