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METHOD FOR FLUORESCENT LABELING OF PROTEIN

Foreign code F130007439
Posted date Jul 4, 2013
Country WIPO
International application number 2012JP052227
International publication number WO 2012105596
Date of international filing Feb 1, 2012
Date of international publication Aug 9, 2012
Priority data
  • P2011-020804 (Feb 2, 2011) JP
Title METHOD FOR FLUORESCENT LABELING OF PROTEIN
Abstract [Problem] To provide a method for the fluorescent labeling of a protein that can even be used for the fluorescent labeling of a biological molecule (protein) in vivo .
[Solution] A method for the fluorescent labeling of a target protein, comprising a step for the intracellular formation of a fused protein of the protein to be labeled and a mutant β-lactamase, a step for using intracellular esterase for the conversion of a compound represented by the following formula (I) or a salt thereof to a compound represented by the following formula (II) or a salt thereof, and a step for the reaction of the fused protein and the compound represented by formula (II) or a salt thereof.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
In recent years, in living organism, the organism to observe the functioning of biomolecules such as proteins is bio-imaging has attracted attention. The observation of the biomolecule function, fluorescently labeled biomolecules and, in the localization of the biological molecule in an organism or to visualize the movement is performed by a general-purpose. As a method of fluorescently labeled biomolecules, using genetic engineering techniques, an object of the fluorescent protein at the end of the biomolecule (protein) to be co-expressed in the commonly-used method. This fluorescent protein, large molecular size, in addition, tissue penetration of near-infrared light fluorescence observation that there is an inconvenience such as difficult. Therefore, small size molecules from the fluorescent protein, and, an organic small molecule fluorescent property has attracted attention. Small organic molecules as a technique for the label to a protein, HaloTag (registered trademark) (manufactured by Promega KK) (for example see non-patent document 1) and SNAP-tag (registered trademark) (for example see non-patent document 2) using a labeling kit has been commercialized. These labeling method, the enzyme reaction using fluorescently labeled biomolecules to the purpose. Therefore, an object of the small organic molecules and the specificity of labeling of the biomolecules is very high when, not binding to a biomolecule fluorescence from small organic molecules, that is observed as the background signal. In order to reduce this background signal, the target biomolecules labeled with a fluorescent small organic molecules, washed, unreacted small organic molecules and needs to be removed. However, in a cell or an organism present in a biological molecule to clean, and is generally difficult, often cannot be washed. Therefore, in vivo cells to observe the biological function of molecules, a general purpose labeling method described above is not efficient. In addition, small organic molecules and biological molecules having the specific sequence for the purpose of linking the peptides may be used to, fluorescently labeled biomolecules has been developed is a method, the method, the specificity of the peptide and small organic molecules and deteriorate.
In order to solve this problem, the inventors of the present invention, already, a compound having the following formulA is used, in vivo cells biomolecule (protein) can be used to label fluorescence, protein provides a method of fluorescently labeling (patent document 1). In this method, mutant β-lactamase protein to be labeled to obtain a fusion protein, the fusion protein and the compound represented by the following formulA or a salt thereof by the reaction, the protein of interest comprises a fluorescent label, and the variant β lactamase, the compound represented by the formulA or a salt thereof to ring-opening so that β - lactam ring, and, wherein the compound or a salt thereof of the β - lactam ring is ring-opening portion is shared with a protein capable of binding, provides the fluorescent labeling of the protein.
In the formulA, X 'is, fluorescent groups and, L1 'is, X' for linker, R1 'is, H, lower alkylcarbonyloxy substituted by a lower alkylene group or a lower alkyl group.
However, a method of using the compound (A) a cell-membrane permeable is low and, as a result, the fluorescence of the biomolecule (protein) in the cell label the poor efficiency in some cases.
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲 [請求項1]
 細胞内タンパク質を蛍光標識する方法であって、
 標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質を細胞内で得ること、
 下記式(I)で表される化合物またはその塩を、細胞内のエステラーゼにより下記式(II)で表される化合物またはその塩へ変換すること、
 および前記融合タンパク質と下記式(II)で表わされる化合物またはその塩とを反応させることにより、前記対象タンパク質を蛍光標識することを含み、
 前記変異型βラクタマーゼは、前記式(II)で表わされる化合物またはその塩のβ-ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ-ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なタンパク質である、タンパク質の蛍光標識方法。
[化21]

前記式(I)および式(II)中、
Xは、蛍光性基であり、
L 1は、Xのためのリンカーであり、
R 1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、3-オキシ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-1-イルである。

[請求項2]
 前記融合タンパク質における前記変異型βラクタマーゼのアミノ酸配列が、
配列表の配列番号1~4のいずれかのアミノ酸配列、
配列表の配列番号1~4のいずれかのアミノ酸配列の1~数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式(II)で表わされる化合物のβ-ラクタム環を開環させ、かつ、前記化合物またはその塩のβ-ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、及び、
配列表の配列番号1~4のいずれかのアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するアミノ酸配列であって、前記融合タンパク質において上記式(II)で表わされる化合物またはその塩のβ-ラクタム環を開環させ、かつ、前記化合物またはその塩のβ-ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列である、請求項1記載の細胞内タンパク質の蛍光標識方法。

[請求項3]
 前記融合タンパク質を得ることが、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを得ること、前記融合タンパク質を発現可能なプラスミド若しくはベクターを得ること、細胞内で前記融合タンパク質を発現させること、又は、発現した前記融合タンパク質を単離することを含む、請求項1又は2に記載の細胞内タンパク質の蛍光標識方法。

[請求項4]
 前記式(I)で表わされる化合物またはその塩を含む請求項1~3のいずれかの方法に用いるための組成物。
[化22]

Xは、蛍光性基であり、
L 1は、Xのためのリンカーであり、
R 1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、3-オキシ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-1-イルである。

[請求項5]
 請求項4に記載の組成物と、
 請求項1~3のいずれかの方法に用いるためのプラスミドまたはベクターを含むタンパク質の蛍光標識方法用キット。
 前記プラスミドまたはベクターは、標識対象タンパク質と変異型βラクタマーゼとの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングするため又は前記融合タンパク質を発現させるためのプラスミド又はベクターであり、
 前記プラスミド又はベクターは、
配列表の配列番号5~8のいずれかの塩基配列
配列表の配列番号5~8のいずれかの塩基配列の1~数個の塩基が欠失、置換、又は付加された塩基配列であって、前記融合タンパク質において式(I)で表わされる化合物またはその塩のβ-ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ-ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、及び、
配列表の配列番号5~8のいずれかの塩基配列と70%以上の相同性を有する塩基配列であって、前記融合タンパク質において式(I)で表わされる化合物またはその塩のβ-ラクタム環を開環させ、その結果、前記化合物またはその塩のβ-ラクタム環が開環した部分と共有結合可能なアミノ酸配列をコードする塩基配列、からなる群から選択される塩基配列を含むプラスミドまたはベクター。
[化23]

Xは、蛍光性基であり、
L 1は、Xのためのリンカーであり、
R 1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、3-オキシ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-1-イルである。

[請求項6]
 一般式(I)で表わされる化合物またはその塩。
[化24]

Xは、蛍光性基であり、
L 1は、Xのためのリンカーであり、
R 1は、低級アルキルオキシカルボニルオキシで置換された低級アルキル基または、3-オキシ-1,3-ジヒドロイソベンゾフラン-1-イルである。

  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • OSAKA UNIVERSITY
  • Inventor
  • KIKUCHI Kazuya
  • MIZUKAMI Shin
  • WATANABE Shuji
  • AKIMOTO Yuri
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LT LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ MD RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG
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