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METHOD FOR IDENTIFYING AND QUANTIFYING TYPES OF ANIMAL HAIR

Foreign code F140007868
File No. S2012-0616-C0
Posted date May 15, 2014
Country WIPO
International application number 2013JP061345
International publication number WO 2013154208
Date of international filing Apr 10, 2013
Date of international publication Oct 17, 2013
Priority data
  • P2012-089662 (Apr 10, 2012) JP
Title METHOD FOR IDENTIFYING AND QUANTIFYING TYPES OF ANIMAL HAIR
Abstract The present invention addresses the issue of providing a method which enables the identification and quantification of types of animal hair from a sample containing animal hair by directly analyzing protein which is the main component of animal hair, rather than using DNA which is present in small quantities. The present invention provides a method in which mass spectrometry of an animal hair sample is carried out, enabling, as a result of the analysis, the mass, mass/charge ratio (m/z), LC elution time for the mass/charge ratio, and a partial sequence useful as a marker to be identified for protein components such as keratin which are the main protein components of animal hair, and types of animal hair to be identified and quantified on the basis of these results.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Cashmere fibers are among the animal hair products, severe natural environment and were taken from the goats for cashmere, has excellent properties such as specific, and high value transactions. However, recently cashmere fibers to mix the animal fiber other disguised quality are generated, which is a problem. With respect to these display clothing, threads or fibers as test methods for the identification of the fibers, according to Japanese Industrial Standards JIS L 1030 by (Method for mixed use of the fiber product), microscopy using the specified test method. In microscopy, as the key for distinguishing the appearance of the hair and the change in the fiber surface by processing the surface of the case to resemble the appearance of the cashmere, may be affected by the identification result. In particular, yak hair brown cashmere closely resembles the shape and surface of the fiber, and cashmere 100% displayed in the product into the hair yaks, a mixed in the mixed hair yaks microscopy an identification is difficult, a more reliable and simple mixing of the bristles into the cashmere yaks method of verification is demanded. Microscopy in addition to the discrimination by the skill of a designer is an identification of the fluctuation is also a possibility. A plurality of persons is usually performed by the paper currency verification is carried out in a reliable discrimination, microscopy interpolation technique as a result the development of methods of verification or fineness was important problem. Discrimination by microscopy techniques as interpolation technique, a method of discrimination by the DNA in recent years have been reported. In particular for the identification of the article of cashmere, Society Japan spinning inspection application number: Japanese Patent Application 2003-297332 (Patent Document 1: Japanese Patent Application Laid-open 2004-121229), Application Society Japan chemical fiber inspection: Japanese 11-15616 (Patent Document 2: Japanese Patent Application Laid-open 2000-210084), application number: Japanese 11-135993 (Patent Document 3: Japanese Patent Application Laid-open 2000-325098) has been made of patent publications such as, application number: Japanese Patent being assessed for 11-15616 (Patent Document 4: patent Publication 3566570). These methods, the presence of a large number of mitochondrial DNA per cell, for example, the cytochrome b based on the sequences of primers were designed to a species-specific DNA, DNA extracted from animal hair product as a template in PCR to amplify the DNA, such as DNA amplification by analyzing the molecular weight of the species are determined. However the present inventors in the development of identification by the DNA has been switched to, in PCR, a criterion of the presence or absence of the position to be identified, and when the amplification from an animal hair may not be amplified depending on the product. Including fibers of hair roots is taken is relatively easy to DNA analysis, hair fiber is free of the hair has been mown, DNA analysis is difficult, so the industry has been mown does not contain the hair fibers is used in most cases. In addition, for such dyes, DNA is not extracted efficiently considered. In addition, for the purpose of amplifying a very small number of DNA, there is also a risk of false positives, in addition, in practice, the problem is difficult to quantify.
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲 [請求項1]
 獣毛を含む試料について前記獣毛の種類を特定及び/又は定量する方法であって、
(a)前記試料から前処理により分析サンプルを得る工程、
(b)前記工程(a)で得た分析サンプルを、質量分析法を用いて分析し結果を得る工程、及び
(c)前記工程(b)で得た結果から、前記獣毛の種類を特定及び/又は定量する工程、
を含むことを特徴とする、獣毛の種類を特定及び/又は定量する方法。

[請求項2]
 前記質量分析法に加えて、液体クロマトグラフィーが質量分析と組み合わせて用いられる(LC-MSもしくはUPLC-MSとも表記する)請求項1記載の方法。

[請求項3]
 前記獣毛の種類が、ウシ科ヤギ属カシミヤ種、ウシ科ヤギ属アンゴラ種、ウシ科ウシ属ヤク種、ウシ科ヒツジ属ヒツジ種、ラクダ科ラクダ属、ラクダ科リャマ属アルパカ種(もしくは、ビクーニャ属アルパカ種)、及びウサギ科アナウサギ属アンゴラウサギ種成る群より選択される1以上の種である、請求項1および2のいずれか1項に記載の方法。

[請求項4]
 前記工程(c)が、前記工程(b)で得た結果を、獣毛の種類を予め確認した参照獣毛の試料について、前記(a)及び(b)の工程を同一条件で行った結果得られた参照データの少なくとも1つと比較し、獣毛種に特異的に検出される質量、及び/又は質量電荷比(m/zとも表記する)、及び/又は該当質量電荷比の溶出時間に基づいて獣毛の種類を特定及び/又は定量する工程
であることを特徴とする、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。

[請求項5]
 前記獣毛の種類を特定及び/又は定量する工程において、
前記参照データが、以下の質量及び質量電荷比から選択される1種以上の質量及び/又は質量電荷比である、請求項4記載の方法。
(I)ヤクについて
(1)ヤク種に特異的に検出される質量: 5948.90 ±0.02%、又は
2137.92 ±0.02%
(2)上記質量に起因する分子イオンの質量電荷比(m/z)又はその他のヤク種に特異的に検出される質量電荷比(m/z):9255.5 ±0.02%、7392.6 ±0.02%、5908.7 ±0.02%、5543.1 ±0.02%、
5949.90 ±0.02%、1983.52 ±0.02%、
1487.64 ±0.02%、1191.52 ±0.02%、
2138.92 ±0.02%、又は1069.98 ±0.02%
(II)カシミヤ種について、
(1)カシミヤ種に特異的に検出される質量:8976.45 ±0.02%、7102.18 ±0.02%、又は7074.18 ±0.02%、
(2)上記質量に起因する分子イオンの質量電荷比(m/z)又は
その他のカシミヤ種に特異的に検出される質量電荷比(m/z):
10384.2 ±0.02%、8976.9 ±0.02%、
6662.2 ±0.02%、6093.2 ±0.02%、6002.2 ±0.02%、
8977.45 ±0.02%、2244.50 ±0.02%、
1795.78 ±0.02%、7103.18 ±0.02%、
1776.54 ±0.02%、1421.44 ±0.02%、
7075.18 ±0.02%、1769.55 ±0.02%、又は
1415.83 ±0.02%
(III)ヒツジ種について
(1)ヒツジ種に特異的に検出される質量:17538.88 ±0.02%、又は
17584.26 ±0.02%
(2)上記質量に起因する分子イオンの質量電荷比(m/z)又はその他のヒツジ種に特異的に検出される質量電荷比(m/z):10339.6 ±0.02%、8954.6 ±0.02%、6665.7 ±0.02%、6036.4 ±0.02%、
17539.88 ±0.02%、1949.84 ±0.02%、
1754.82 ±0.02%、1595.47 ±0.02%、
17585.26 ±0.02%、1955.10 ±0.02%、
1759.47 ±0.02%、又は1599.55 ±0.02%
(IV)アンゴラ種(モヘヤとも表記する)について
(1)アンゴラ種に特異的に検出される質量:
6329.52 ±0.02%
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)
(V)ラクダ科リャマ属アルパカ種(もしくは、ビクーニャ属アルパカ種)について
(1)アルパカ種に特異的に検出される質量:
6358.60 ±0.02%、又は6342,70 ±0.02%
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)
(VI)ウサギ科アナウサギ属アンゴラウサギ種(アンゴラとも表記する)
(1)アンゴラウサギ種に特異的に検出される質量:1042.43 ±0.02%
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)

[請求項6]
 前記試料から前処理により分析サンプルを得る工程(a)が、リジルエンドペプチダーゼ(Lys-Cとも表記する)を用いる工程を含む請求項1~3いずれか1項に記載の方法。

[請求項7]
 前記工程(c)が、前記工程(b)で得た結果を、獣毛の種類を予め確認した参照獣毛の試料について、前記工程(a)及び工程(b)を同一条件で行った結果得られた参照データの少なくとも1つと比較し、獣毛種に特異的に検出される質量、及び/又は質量電荷比(m/zとも表記する)、及び/又は該当質量電荷比の溶出時間に基づいて獣毛の種類を特定及び/又は定量する工程であることを特徴とする、請求項6に記載の方法。

[請求項8]
 前記工程(c)において、前記工程(b)で得た結果を、データ処理により溶出時間と検出質量電荷比および検出強度を表したマップ表示とし、獣毛の種類を予め確認した参照獣毛の試料について、前記工程(a)及び工程(b)を同一条件で行った結果得られた参照マップの少なくとも1つと比較し、その相関度をもって獣毛の種類を特定する工程であることを特徴とする、請求項6に記載の獣毛の種類の特定方法。

[請求項9]
 前記獣毛の種類を特定及び/又は定量する工程において、前記参照データが、以下の質量及び質量電荷比から選択される1種以上の質量及び/又は質量電荷比である、請求項7記載の方法。
(I)ウシ科ウシ属ヤク種について
(1)ヤク種に特異的に検出される質量
1364.70 ±0.02%、1383.72 ±0.02%、
1431.67 ±0.02%、2469.27 ±0.02%、又は
2495.30 ±0.02%
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)
(II)ウシ科ヤギ属カシミヤ種について
(1)カシミヤ種に特異的に検出される質量、
2218.19 ±0.02%、3379.48 ±0.02%、又は
2391.99 ±0.02%、
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)
(III)ウシ科ヒツジ属ヒツジ種について
(1)ヒツジ種に特異的に検出される質量、
2479.30 ±0.02%、4977.24 ±0.02%、
2340.03 ±0.02%、2358.02 ±0.02%、
1051.41 ±0.02%、1033.39 ±0.02%、
2074.12 ±0.02%、又は2174.00 ±0.02%、
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)
(IV)ラクダ科ラクダ属について
(1)ラクダ属に特異的に検出される質量、2888.35 ±0.02%、
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)
(V)ラクダ科リャマ属アルパカ種(もしくは、ビクーニャ属アルパカ種)について
(1)アルパカ種(もしくは、ビクーニャ属アルパカ種)に特異的に検出される質量、
4599.37 ±0.02%、901.47 ±0.02%、又は
532.32 ±0.02%、
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)
(VI)ウサギ科アナウサギ属アンゴラウサギ種
(1)アンゴラウサギ種に特異的に検出される質量、
2303.07±0.02%、2502.15±0.02%、
2058.02±0.02%、又は1554.81±0.02%、
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)

[請求項10]
 前記参照データがヤク種に特異的な質量電荷比であって、配列番号1で表されるアミノ酸配列を含むペプチド及び/又はタンパク質による分子イオンの質量電荷比であることを特徴とする、請求項7又は9記載の方法。

[請求項11]
 以下の(1)-(5)のいずれかの獣毛マーカー。
(1)配列番号1で示されるヤク種獣毛に特異的なペプチドマーカー。
(2)配列番号3で示されるカシミヤ獣毛に特異的なペプチドマーカー。
(3)配列番号4~9で示されるアミノ酸配列の2つ以上組み合わせを含むヒツジ獣毛に特異的なペプチドマーカー。
(4)配列番号10~13で示されるアミノ酸配列の2つ以上組み合わせを含むヒツジ獣毛に特異的なペプチドマーカー。
(5)配列番号2で示されるヤク種獣毛に特異的な核酸マーカー

[請求項12]
 2種類の獣毛を含む試料について、その混用率を算出する方法であって、
(a)前記試料から前処理により分析サンプルを得る工程、
(b)前記工程(a)で得た分析サンプルを、質量分析法を用いて分析し結果を得る工程
(c)前記(a)及び(b)の工程を同一条件で、2種の片方について、当該獣種の獣毛試料の全質量のイオンクロマトグラムから該獣種に特異的な質量電荷比のみを抽出して表示させたイオンクロマトグラムを作成し、このクロマトグラムをデータ処理し、当該獣毛種特異的質量電荷比のピーク面積を算出する工程、及び
(d)ピーク面積から混用率を算出する工程、を含む、
前記混用率算出方法。

[請求項13]
 前記工程(d)の前に、
(イ)2種共通の分子種由来の質量電荷比(m/z)についてのイオンクロマトグラムを作成し、各獣毛に共通する質量電荷比を選択し、該共通質量電荷比のピーク面積を求める工程
(ロ)共通質量電荷比のピーク面積に対して獣種に特異的な質量電荷比のピーク面積を算出する工程、
を追加した、請求項12記載の方法。

[請求項14]
 はじめに、獣毛の種類を予め確認した参照獣毛を人為的に混用した試料を用い、ピーク面積と混用率をグラフ化し、検量線を作成し、未知試料においてこの検量線を用いピーク面積から混用率を算出する、請求項12又は13記載の方法。

[請求項15]
 1以上の種類の獣毛を含む試料について前記獣毛の種類を特定し、獣毛の種類が2以上の場合には、その混用率を算出する方法であって、
(a)前記試料から前処理により分析サンプルを得る工程、
(b)前記工程(a)で得た分析サンプルを、質量分析法を用いて分析し結果を得る工程
(c)前記工程(b)で得た結果から、前記獣毛の種類を特定する工程
(d)前記特定された獣毛の種類が2以上の場合には、同定されたそれぞれ獣種について、当該特定された獣特異的質量電荷比のピーク面積を算出し、
(e)当該獣種が100%参照試料のピーク面積と比較し、当該獣種の混用率を算定する工程を含む前記混用率算出方法。

[請求項16]
 前記工程(e)の前に、
(イ)混用種共通の分子種由来の質量電荷比(m/z)についてのイオンクロマトグラムを作成し、各獣毛に共通する質量電荷比を選択し、該共通質量電荷比のピーク面積を求める工程
(ロ)共通質量電荷比のピーク面積に対して獣種に特異的な質量電荷比のピーク面積を算出する工程、
を追加した、請求項15記載の方法。

[請求項17]
 2以上の種類(以下N種と記載)の獣毛を含む試料において、(N-1)種類の獣毛種の混用率を算出し、100%からの差によりN種の混用率を求める、請求項12~16のいずれか1項に記載の方法。

[請求項18]
 1以上の種類の獣毛と獣毛以外の繊維とを含む試料について、その獣毛に関する混用率を算出する方法であって、
前記試料から前処理により分析サンプルを得る工程(a)の前、又は、獣毛に関しての混用率算出の工程後に、JIS L1030により規定されている解じょ法や溶解法などによる獣毛以外の繊維と獣毛の混用割合を算出する工程を含む、請求項12~17いずれか1項に記載の方法。

[請求項19]
 前記獣種に特異的な質量電荷比が、以下の質量電荷比から選ばれる1以上の質量電荷比である、請求項12~18のいずれか1項に記載の方法。
(I)ヤク種について
(1)ヤク種に特異的に検出される質量:
5948.90 ±0.02%、又は2137.92 ±0.02%
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)又はその他のヤク種に特異的に検出される質量電荷比(m/z):9255.5 ±0.02%、7392.6 ±0.02%、5908.7 ±0.02%、
5543.1 ±0.02%、5949.90 ±0.02%、
1983.52 ±0.02%、1487.64 ±0.02%、
1191.52 ±0.02%、2138.92 ±0.02%、又は
1069.98 ±0.02%
(II)カシミヤ種について、
(1)カシミヤ種に特異的に検出される質量:
8976.45 ±0.02%、7102.18 ±0.02%、又は
7074.18 ±0.02%、
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)又はその他のカシミヤ種に特異的に検出される質量電荷比(m/z):
10384.2 ±0.02%、8976.9 ±0.02%、
6662.2 ±0.02%、6093.2 ±0.02%、6002.2 ±0.02%、8977.45 ±0.02%、2244.50 ±0.02%、
1795.78 ±0.02%、7103.18 ±0.02%、
1776.54 ±0.02%、1421.44 ±0.02%、
7075.18 ±0.02%、1769.55 ±0.02%、又は
1415.83 ±0.02%
(III)ヒツジ種について
(1)ヒツジ種に特異的に検出される質量:17538.88 ±0.02%、又は
17584.26 ±0.02%
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)又は
その他のヒツジ種に特異的に検出される質量電荷比(m/z):
10339.6 ±0.02%、8954.6 ±0.02%、
6665.7 ±0.02%、6036.4 ±0.02%、
17539.88 ±0.02%、1949.84 ±0.02%、
1754.82 ±0.02%、1595.47 ±0.02%、
17585.26 ±0.02%、1955.10 ±0.02%、
1759.47 ±0.02%、又は1599.55 ±0.02%
(IV)アンゴラ種(モヘヤとも表記する)について
(1)アンゴラ種に特異的に検出される質量:6329.52 ±0.02%
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)
(V)ラクダ科リャマ属アルパカ種(もしくは、ビクーニャ属アルパカ種)について
(1)アルパカ種に特異的に検出される質量:
6358.60 ±0.02%、又は6342,70 ±0.02%
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)
(VI)ウサギ科アナウサギ属アンゴラウサギ種(アンゴラとも表記する)
(1)アンゴラウサギ種に特異的に検出される質量:1042.43 ±0.02%
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)

[請求項20]
 前記試料から前処理により分析サンプルを得る工程(a)が、リジルエンドペプチダーゼ(Lys-Cとも表記する)を用いる工程を含み、前記獣種に特異的な質量電荷比が、以下の質量電荷比から選ばれる1以上の質量電荷比である、請求項12~18のいずれか1項に記載の方法。
(I)ウシ科ウシ属ヤク種について
(1)ヤク種に特異的に検出される質量
1364.70 ±0.02%、1383.72 ±0.02%、
1431.67 ±0.02%、2469.27 ±0.02%、又は
2495.30 ±0.02%
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)
(II)ウシ科ヤギ属カシミヤ種について
(1)カシミヤ種に特異的に検出される質量、
2218.19 ±0.02%、3379.48 ±0.02%、又は
2391.99 ±0.02%、
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)
(III)ウシ科ヒツジ属ヒツジ種について
(1)ヒツジ種に特異的に検出される質量、
2479.30 ±0.02%、4977.24 ±0.02%、
2340.03 ±0.02%、2358.02 ±0.02%、
1051.41 ±0.02%、1033.39 ±0.02%、
2074.12 ±0.02%、又は2174.00 ±0.02%、
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)
(IV)ラクダ科ラクダ属について
(1)ラクダ属に特異的に検出される質量、2888.35 ±0.02%、
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)
(V)ラクダ科リャマ属アルパカ種(もしくは、ビクーニャ属アルパカ種)について
(1)アルパカ種(もしくは、ビクーニャ属アルパカ種)に特異的に検出される質量、
4599.37 ±0.02%、901.47 ±0.02%、又は
532.32 ±0.02%、
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)
(VI)ウサギ科アナウサギ属アンゴラウサギ種
(1)アンゴラウサギ種に特異的に検出される質量、
2303.07±0.02%、2502.15±0.02%、
2058.02±0.02%、又は1554.81±0.02%、
(2)上記(1)記載の質量から算出される分子イオンの質量電荷比(m/z)

[請求項21]
 前記試料から前処理により分析サンプルを得る工程(a)が、リジルエンドペプチダーゼ(Lys-Cとも表記する)を用いる工程を含み、ヤク種、カシミヤ種、及びヒツジ種に共通な質量電荷比(m/z)が、以下に掲げる質量電荷比から選ばれる1以上の質量電荷比である、
請求項13又は16記載の方法。
(1)質量1070.5  ±0.02% から算出される分子イオンの質量電荷比
(2)質量1555.76 ±0.02% から算出される分子イオンの質量電荷比
(3)質量1160.58 ±0.02% から算出される分子イオンの質量電荷比
(4)質量 602.30 ±0.02% から算出される分子イオンの質量電荷比

[請求項22]
 試料中の獣毛を定量する方法であって、
(a)前記試料から前処理により分析サンプルを得る工程、及び
(b)前記工程(a)で得た分析サンプルに、安定同位体を含む獣毛マーカーを加え、質量分析法を用いて分析し結果を得る工程
(c)獣特異的質量電荷比のピーク面積および安定同位体を含む獣毛マーカーの質量電荷比のピーク面積を算出し、分析サンプルに加えた獣毛マーカーの濃度から、獣毛マーカーの質量電荷比のピーク面積を濃度もしくは量に換算し、
(d)抽出液試料由来のピーク面積と比較することで抽出液試料に含まれる獣毛の定量を行う工程
を含む前記定量方法。

[請求項23]
 前記試料から前処理により分析サンプルを得る工程(a)が、リジルエンドペプチダーゼを用いる工程を含み、獣毛マーカーが、請求項11記載のいずれか1つのペプチドマーカーである、請求項22記載の方法。

  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • GIFU UNIVERSITY
  • KE'KEN TEXTILE TESTING AND CERTIFICATION CENTER
  • Inventor
  • NISHIKAWA, Kazuya
  • YOKOGAWA, Takashi
  • OHNO, Satoshi
  • HAYASHI, Katsumasa
  • MATSUNAGA, Nobuyoshi
  • MOTOYAMA, Aya
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IS JP KE KG KM KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LT LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW ML MR NE SN TD TG
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