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SIMPLE DETECTION METHOD FOR RNA MODIFICATION, AND METHOD FOR DETECTING TYPE-II DIABETES USING SAID DETECTION METHOD

Foreign code F150008201
Posted date Mar 25, 2015
Country WIPO
International application number 2014JP055758
International publication number WO 2014136870
Date of international filing Mar 6, 2014
Date of international publication Sep 12, 2014
Priority data
  • P2013-047278 (Mar 8, 2013) JP
  • P2013-150133 (Jul 19, 2013) JP
Title SIMPLE DETECTION METHOD FOR RNA MODIFICATION, AND METHOD FOR DETECTING TYPE-II DIABETES USING SAID DETECTION METHOD
Abstract Provided is a method for detecting modifications present in RNA using small-volume RNA samples. Also provided is a method for detecting modifications in tRNA, such as thio methylation. Also provided is a method of diagnosing human type-II diabetes or the risk thereof, by detecting the thio methylation of tRNA. The present invention is characterized by the generation of cDNA by reverse transcription of RNA using a first primer, and comparing that quantity of cDNA with the quantity of cDNA generated by reverse transcription from RNA using a second primer, thereby detecting modifications (e.g. thio methylation) present in RNA in an RNA sample.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
RNAに存在するRNA修飾を検出するための方法であって、
以下の2つの工程:
a.第1プライマーを用いて、該RNAから逆転写によりcDNAを生成する工程、ここで、該第1プライマーは、該RNA上の該RNA修飾を有する部位を含む領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである、
b.第2プライマーを用いて、該RNAから逆転写によりcDNAを生成する工程、ここで、該第2プライマーは、該RNA上の該RNA修飾を有する部位より上流側(3’側)の領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである、
をそれぞれ別々又は同時に行い、それぞれの工程から生成されたcDNA量の差を測定することにより該RNA修飾を検出する方法。
[請求項2]
前記工程aとbを別々に行う請求項1に記載の方法。
[請求項3]
前記cDNA量の差を核酸増幅反応又は蛍光法により測定する請求項1又は2に記載の方法。
[請求項4]
前記核酸増幅反応が、定量PCR法又はリアルタイム定量PCR法を用いて行われる、請求項3に記載の方法。
[請求項5]
前記cDNA量の差を、核酸増幅反応における核酸の増幅速度の差として測定する、請求項4に記載の方法。
[請求項6]
前記RNAがtRNAである請求項1~5のいずれか一つに記載の方法。
[請求項7]
前記RNAに存在するRNA修飾が、tRNAに存在するチオメチル化、メチル化又はタウリン化である、請求項6に記載の方法。
[請求項8]
前記tRNAに存在するチオメチル化が、Lysに対応するtRNA、Trpに対するtRNA、Pheに対するtRNA、又はSer(UCN)に対するtRNAのいずれかの37番目のアデノシンのチオメチル化である、請求項7に記載の方法。
[請求項9]
前記tRNAに存在するチオメチル化が、Lysに対応するtRNAの37番目のアデノシンのチオメチル化である、請求項8に記載の方法。
[請求項10]
前記RNAがヒト組織又はヒト血液由来のRNAを含む、請求項1~9のいずれか一つに記載の方法。
[請求項11]
前記RNAがヒト末梢血由来のRNAを含む請求項10に記載の方法。
[請求項12]
RNAに存在するRNA修飾率が既知の少なくとも2つの試料、及びRNA修飾率が未知の試料、のそれぞれについて請求項1~11のいずれか一つに記載の方法を行い、それぞれの試料について測定されたcDNA量の差を示すパラメーターを比較することにより、未知の試料中のRNA修飾率を測定する方法。
[請求項13]
前記核酸増幅反応が定量PCR法又はリアルタイム定量PCR法であり、かつ前記パラメーターが、第1のプライマー及び第2のプライマーを用いた際の標的核酸増幅のための閾値サイクル数(threshold cycle)の差である、請求項12に記載の方法。
[請求項14]
RNAに存在するRNA修飾率が未知の試料について請求項1~11のいずれか一つに記載の方法を行い、該試料について測定されたcDNA量の差を示すパラメーターを予め決められている検量線と比較することにより、未知の試料中のRNA修飾率を測定する方法。
[請求項15]
前記核酸増幅反応が定量PCR法又はリアルタイム定量PCR法であり、かつ前記パラメーターが、第1のプライマー及び第2のプライマーを用いた際の標的核酸増幅のための閾値サイクル数(threshold cycle)の差である、請求項14に記載の方法。
[請求項16]
試料中のRNAに存在するRNA修飾を検出するためのキットであって、
該RNA上の該RNA修飾を有する部位を含む領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである第1のプライマー、および
該RNA上の該RNA修飾を有する部位より3’側の領域と相補的に結合するように設計されたオリゴヌクレオチドである第2のプライマー、
を含むキット。
[請求項17]
前記RNAがtRNAである請求項16に記載のキット。
[請求項18]
前記RNAに存在するRNA修飾が、tRNAに存在するチオメチル化である、請求項17に記載のキット。
[請求項19]
前記tRNAに存在するチオメチル化が、Lysに対応するtRNA、Trpに対するtRNA、Pheに対するtRNA、又はSer(UCN)に対するtRNAのいずれかの37番目のアデノシンのチオメチル化である、請求項18に記載のキット。
[請求項20]
さらに、PCRを行うための別のプライマーを含む、請求項16~19のいずれか一つに記載のキット。
[請求項21]
請求項9に記載の方法を用いて、前記tRNAが由来する被験者が2型糖尿病患者又はそのリスクがあるか否かを判定する方法。
[請求項22]
前記tRNAは、被験者の組織又は血液に由来するtRNAである請求項21に記載の方法。
[請求項23]
請求項9に記載の方法を用いて、前記tRNAが由来する被験者のインスリン分泌能を検定する方法。
[請求項24]
前記tRNAは、被験者の組織又は血液に由来するtRNAである請求項23に記載の方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • KUMAMOTO UNIVERSITY
  • Inventor
  • TOMIZAWA KAZUHITO
  • WEI FANYAN
  • SUZUKI TAKEO
  • SUZUKI TSUTOMU
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LT LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN TD TG
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