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POLYPEPTIDE FOR FORSTER RESONANCE ENERGY TRANSFER

Foreign code F150008257
Posted date Mar 27, 2015
Country WIPO
International application number 2014JP060185
International publication number WO 2014168143
Date of international filing Apr 8, 2014
Date of international publication Oct 16, 2014
Priority data
  • P2013-080738 (Apr 8, 2013) JP
Title POLYPEPTIDE FOR FORSTER RESONANCE ENERGY TRANSFER
Abstract The purpose of the present invention is to provide a method for measuring the activity of a tyrosine kinase with high efficiency while reducing the number of cells which cannot be evaluated with respect to FRET. The problem can be solved by a polypeptide which is selected from polypeptides (1) and (2) as mentioned below and to which a donor and an acceptor for inducing Forster resonance energy transfer are bound: (1) a polypeptide which comprises an amino acid sequence that has the substitution of at least one amino acid residue selected from amino acid residues lying between position-91 to position-97 and/or at least one amino acid residue selected from amino acid residues lying between position-201 to position-222 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2; and (2) a polypeptide which comprises an amino acid sequence that has the deletion of 1st to 81st amino acid residues as numbered from the carboxyl terminal side and also has the substitution of at least one amino acid residue selected from amino acid residues lying between position-91 to position-97 and/or at least one amino acid residue selected from amino acid residues lying between position-201 to position-222 in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Leukemia, standing and serious complications leading to death by blood tumor disorder. Which is a kind of leukemia chronic myelogenous leukemia (CML) acute lymphoblastic leukemia (ALL) and a part of in, 9, 22 caused by the reciprocal translocation chromosome characteristic Philadelphia (Ph1) bcr-abl chromosomal translocation is formed by the fusion gene, the constitutive tyrosine kinase activity from this gene (BCR-ABL) cytoplasmic proteins can be expressed, this BCR-ABL tyrosine kinase activity of phosphorylated by a variety of proteins can be associated with the onset, and the like are known.
As a method for the treatment of leukemia, in general, such as anti-cancer treatment or hematopoietic stem cell transplantation by administering a pharmaceutically transplantation treatment of either, or both is selected. In particular, pharmaceutical treatment CML, 2 - phenylaminopyrimidine tyrosine kinase inhibitor-based compounds and made about the administration, at present, 'imatinib' is a registered trademark of (imatinib, STI-571 or registered trademark name Gleevec also referred to as) the administration of the standard pharmaceutical therapy at present.
Imatinib, BCR-ABL ATP in the kinase domain binding site of the target, a high selectivity of a molecular target which is a kind of the drug. In general, the use of a molecular target drug, and the specificity of the effect expected from the high safety, which is one of the ideal therapy. But at the same time, the use of molecular target drugs, to patients with a mutation in a target molecule exhibits the desired therapeutic effect is expected with a problem that it is difficult in many cases, typified by BCR-ABL Imatinib and a targeting molecule-based compounds such as phenylaminopyrimidine tyrosine kinase inhibitor 2 - more or not.
Therefore, by BCR-ABL kinase domain mutations, such as imatinib (tyrosine kinase inhibitor) patient effect cannot be obtained in order to find, important to examine drug resistance. Conventional, inspection of imatinib resistance in a patient, mainly, bcr-abl gene of the patient and determine the sequence of the BCR-ABL of the types of mutations that (for example non-patent document 1) a method for checking BCR-ABL substrate protein or of a method for detecting phosphorylation of CrkL immunoblotting (for example non-patent document 2) by, has been carried out.
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲 [請求項1]
 (1)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、91番~97番の少なくとも1つのアミノ酸及び/又は201番~222番の少なくとも1つのアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、
(2)配列番号2で表されるアミノ酸配列において、カルボキシル末端側から1~81個のアミノ酸が欠失しており、且つ91番~97番の少なくとも1つのアミノ酸及び/又は201番~222番の少なくとも1つのアミノ酸が置換されているアミノ酸配列からなるポリペプチド、又は
(3)前記ポリペプチド(1)又はポリペプチド(2)のアミノ酸配列において、1又は複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかもフェルスター共鳴エネルギー移動を誘導するドナー及びアクセプターが結合した場合に、BCR-ABLによるリン酸化に伴いフェルスター共鳴エネルギー移動を誘導する活性を示すポリペプチド、
であって、91番~97番及び201番~222番のアミノ酸が置換されていないポリペプチドと比較して切断が抑制されるポリペプチド。

[請求項2]
 前記91番~97番のアミノ酸の置換が、94番のアミノ酸の置換である、請求項1に記載のポリペプチド。

[請求項3]
 前記91番~97番のアミノ酸の置換が、94番のアスパラギン酸からアラニンへの置換である、請求項1又は2に記載のポリペプチド。

[請求項4]
 フェルスター共鳴エネルギー移動を誘導するドナー及びアクセプターが結合した、請求項1~3のいずれか一項に記載のポリペプチド。

[請求項5]
 前記ドナーとして蛍光タンパク質若しくは生物発光タンパク質が、又は前記ドナーの結合タグとして蛍光化合物結合ポリペプチドが、前記ポリペプチドのN末端又はC末端の一方に結合し、そして前記アクセプターとして蛍光タンパク質が、又は前記アクセプターの結合タグとして蛍光化合物結合ポリペプチドが、前記ポリペプチドのN末端又はC末端の他方に結合している、請求項1~3のいずれか一項に記載のポリペプチド。

[請求項6]
 前記ドナー及びアクセプターの蛍光タンパク質がGFP、eGFP、YFP、CFP、DsRed、MiCy、mKO、及びそれらの変異体からなる群から選択される、請求項5に記載のポリペプチド。

[請求項7]
 核外搬出シグナルを更に含む、請求項5又は6に記載のポリペプチド。

[請求項8]
 配列番号4、6、8、又は19で表されるアミノ酸配列からなる請求項5又は6に記載のポリペプチド。

[請求項9]
 配列番号4で表されるアミノ酸配列における545番~547番の少なくとも1つのアミノ酸、配列番号6で表されるアミノ酸配列における464番~466番の少なくとも1つのアミノ酸、配列番号8で表されるアミノ酸配列における464番~466番の少なくとも1つのアミノ酸、又は配列番号19で表されるアミノ酸配列における468番~470番の少なくとも1つのアミノ酸が置換されている請求項8に記載のポリペプチド。

[請求項10]
 請求項4~9のいずれか一項に記載のポリペプチドと、患者由来の細胞とを接触させる工程、及び
前記アクセプターの蛍光発光、又はアクセプターの蛍光発光及びドナーの生物発光若しくは蛍光発光を検出する工程、
を含む、チロシンキナーゼ活性の測定方法。

[請求項11]
 前記チロシンキナーゼ活性が、BCR-ABL、c-Abl、又は上皮増殖因子受容体のチロシンキナーゼ活性である、請求項10に記載の方法。

[請求項12]
 前記細胞が腫瘍細胞である、請求項10又は11に記載の方法。

[請求項13]
 チロシンキナーゼ阻害剤、請求項4~9のいずれか一項に記載のポリペプチドと、患者由来の細胞とを接触させる工程、及び
前記アクセプターの蛍光発光、又はアクセプターの蛍光発光及びドナーの生物発光若しくは蛍光発光を検出する工程、
を含む、前記細胞のチロシンキナーゼ阻害剤に対する抵抗性を確認する方法。

[請求項14]
 前記細胞が腫瘍細胞である、請求項13に記載の方法。

[請求項15]
 試験化合物の存在下で、請求項4~9のいずれか一項に記載のポリペプチドと、BCR-ABL、c-Abl、若しくは上皮増殖因子受容体とを接触させる工程、及び
前記アクセプターの蛍光発光、又はアクセプターの蛍光発光及びドナーの生物発光若しくは蛍光発光を測定する工程、
を含む、チロシンキナーゼ活性に対する阻害剤をスクリーニングする方法。

[請求項16]
 前記ポリペプチド、及びBCR-ABL、c-Abl、若しくは上皮増殖因子受容体の接触が、細胞内で行われる請求項15に記載のスクリーニング方法。

  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION HOKKAIDO UNIVERSITY
  • Inventor
  • OHBA Yusuke
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LT LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN TD TG
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