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HYDROGEL SUBSTRATE FOR CELL EVALUATION, AND CELL EVALUATION METHOD

Foreign code F150008307
File No. S2014-1368-N0
Posted date Apr 13, 2015
Country WIPO
International application number 2014JP053578
International publication number WO 2014126228
Date of international filing Feb 17, 2014
Date of international publication Aug 21, 2014
Priority data
  • P2013-028485 (Feb 16, 2013) JP
Title HYDROGEL SUBSTRATE FOR CELL EVALUATION, AND CELL EVALUATION METHOD
Abstract In order to more accurately evaluate the infiltration behavior of cancer cells under conditions approaching the environment in a living body than the prior art, a novel cell culture system, which is a three-dimensional environment and in which a plurality of types of cells co-exist, is constructed. For that purpose, a hydrogel substrate for cell evaluation, which is constituted by hydrogel and has a fiber- or sheet-like form, is used. The hydrogel substrate has a region (A) inside a cross section (S) in a plane perpendicular to a longitudinal axis, the periphery of which does not touch the periphery of the cross section (S) and which contains first cells. In addition, the region (A) is constituted by hydrogel with a low modulus of elasticity compared to a region (B) outside the region (A) in the cross section (S).
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
ハイドロゲルによって構成され、 ファイバー状又はシート状の形態を有し、 長さ方向の軸に対して垂直な平面における断面Sの内部において、周縁部が前記断面Sの周縁部に接しておらずかつ第一の細胞が存在する領域Aを有し、 さらに前記領域Aは、前記断面Sにおける前記領域A以外の領域Bと比較して、弾性率の低いハイドロゲルによって構成されている細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項2]
前記ハイドロゲル基材は、前記断面Sにおいて部分的に前記領域A及び前記領域Bに接し、かつ、部分的に前記断面Sの周縁部に接する領域Cを有し、 さらに前記領域Cは、前記領域Bと比較して弾性率の低いハイドロゲルによって構成されている請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項3]
領域Bには、前記第一の細胞とは異なる第二の細胞が存在する請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項4]
前記領域Cには、前記第二の細胞が存在する請求項2に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項5]
前記領域A、前記領域B及び領域Cを構成するハイドロゲルの少なくともいずれかは、アルギン酸又はアルギン酸の誘導体によって構成されている請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項6]
前記領域A及び前記領域Cを構成するハイドロゲルの少なくともいずれかには、アルギン酸プロピレングリコールが含まれている請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項7]
前記領域A、前記領域B及び領域Cを構成するハイドロゲルのマトリックス中には、細胞外マトリックスを構成するタンパク質及び細胞接着性のペプチド分子の少なくともいずれかが含まれている請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項8]
前記第一の細胞とは、癌細胞である請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項9]
前記第二の細胞とは、癌細胞以外の細胞である請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項10]
前記第二の細胞とは、繊維芽細胞、内皮細胞、上皮細胞、平滑筋細胞、骨格筋細胞、中皮細胞、実質細胞、腺細胞、表皮細胞、神経細胞、骨芽細胞、これらの細胞の前駆細胞、各種幹細胞より分化させた細胞の少なくともいずれかである請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項11]
前記領域Aの面積は、前記第一の細胞の平均直径をDとすると、10D2以下である請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項12]
前記領域Aの面積をSとし、前記領域Aの周囲長をLとすると、前記領域Aの円形度4πS/L2は0.5以上である請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項13]
前記第一の細胞の平均直径をDとすると、領域Cの幅は3D以下である請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項14]
直径500マイクロメートル以下のファイバー状である請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項15]
厚さ500マイクロメートル以下のシート状であり、前記断面Sの内部において、前記領域Aは複数個所存在する請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項16]
前記領域Aに含まれる、前記第一の細胞の密度は、1立方センチメートル当たり10万個以上である請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項17]
前記領域B及び前記領域Cに含まれる、前記第二の細胞の密度は、1立方センチメートル当たり100万個以上である請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項18]
少なくとも2つの入口I1~In(n≧2)と、前記入口I1~Inにそれぞれ接続する入口流路CI1~CInと、前記入口流路CI1~CInが同時あるいは段階的に合流する少なくとも1つの合流点P1~Pm(m≧1)と、前記合流点P1~Pmより下流に存在する合流流路Gと、前記合流流路Gの下流に存在する出口Oを有する、流路構造Xに対し、アルギン酸ナトリウムを含み、かつ前記第一の細胞を懸濁させた、第一の水溶液を、前記入口I1を介して、また、アルギン酸ナトリウムを含む第二の水溶液を、前記入口I2を介して、それぞれ連続的に導入し、 前記流路構造Xの内部において、前記第一の水溶液および前記第二の水溶液を接触させ、さらに前記流路構造Xの内部乃至外部において、前記第一の水溶液および前記第二の水溶液をゲル化剤水溶液と接触させることによって、 前記第一の水溶液及び前記第二の水溶液が接触した状態で連続的にゲル化することによって作製されたものであり、 また、前記領域Aは前記第一の水溶液がゲル化することによって形成されたものであり、かつ、前記領域Bは前記第二の水溶液がゲル化することによって形成されたものである請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項19]
少なくとも3つの入口I1~In(n≧3)と、前記入口I1~Inにそれぞれ接続する入口流路CI1~CInと、前記入口流路CI1~CInが同時あるいは段階的に合流する少なくとも1つの合流点P1~Pm(m≧1)と、前記合流点P1~Pmより下流に存在する合流流路Gと、前記合流流路Gの下流に存在する出口Oを有する、流路構造Xに対し、アルギン酸ナトリウムを含み、かつ前記第一の細胞を懸濁させた、第一の水溶液を、前記入口I1を介して、また、アルギン酸ナトリウムを含む第二の水溶液を、前記入口I2を介して、さらに、アルギン酸ナトリウムを含む第三の水溶液を、前記入口I3を介して、それぞれ連続的に導入し、 前記流路構造Xの内部において、前記第一の水溶液、前記第二の水溶液、前記第三の水溶液を接触させ、 さらに、前記流路構造Xの内部又は外部において、前記第一の水溶液、前記第二の水溶液、および前記第三の水溶液をゲル化剤水溶液と接触させることによって、前記第一の水溶液および前記第二の水溶液が接触した状態で連続的にゲル化することによって作製されたものであり、 また、前記領域Aは前記第一の水溶液がゲル化することによって形成されたものであり、かつ、前記領域Bは前記第二の水溶液がゲル化することによって形成されたものであり、さらに、前記領域Cは前記第三の水溶液がゲル化することによって形成されたものである請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項20]
前記第二の水溶液及び前記第三の水溶液の少なくともいずれかには、前記第二の細胞が懸濁されている請求項18に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項21]
前記流路構造Xは、少なくとも一つの入口G1~Gn(n≧1)および、前記入口G1~Gnにそれぞれ接続し合流点P1~Pmのいずれかにおいて合流流路Gに合流する入口流路CG1~CGnを有しており、前記入口G1~Gnを介して前記ゲル化剤水溶液は流路構造Xに連続的に導入される請求項18に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項22]
前記流路構造Xは、少なくとも一つの入口B1~Bn(n≧1)および、前記入口B1~Bnにそれぞれ接続し合流点P1~Pmのいずれかにおいて合流流路Gに合流する入口流路CB1~CBnを有しており、前記入口B1~Bnを介して、バッファー水溶液は流路構造Xに連続的に導入される請求項18に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項23]
前記合流点P1~Pmのうち少なくとも一つの合流点において、前記第一の水溶液は、その上下左右の少なくともいずれかにおいて前記第二の水溶液と接触する請求項18に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項24]
前記流路構造Xは、少なくとも部分的に、キャピラリー状の管によって構成されている請求項18に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項25]
前記流路構造Xは、少なくとも部分的に、微細加工技術を用いて作製されたマイクロ流路構造によって構成されている請求項18に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項26]
前記流路構造Xは、その幅、深さ、直径の値のうち少なくともいずれか一つが、少なくとも部分的に1ミリメートル以下である請求項18に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項27]
前記第一の水溶液、前記第二の水溶液及び前記第三の水溶液の少なくともいずれかに含まれるアルギン酸ナトリウムの濃度は、それぞれ100mLあたり1g以下である請求項18に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項28]
前記第二の水溶液に含まれるアルギン酸ナトリウムの濃度は、100mLあたり1g以上である請求項18に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項29]
前記ゲル化剤水溶液は、塩化バリウムを含む請求項18に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項30]
前記ゲル化剤水溶液乃至前記バッファー水溶液は、増粘剤を含む請求項18に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項31]
前記第一の水溶液乃至前記第三の水溶液は、アルギン酸プロピレングリコールを含む請求項18に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項32]
前記第一の水溶液乃至前記第三の水溶液に含まれる前記アルギン酸プロピレングリコールの濃度は、それぞれ100mLあたり1g以上である請求項31に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材。
[請求項33]
請求項1に記載の細胞評価用ハイドロゲル基材を用いる細胞評価手法。
[請求項34]
前記ハイドロゲル基材内部に包埋した細胞に対し、培養操作を行い、前記第一の細胞が前記ハイドロゲル基材の内部を浸潤しゲル外部にまで達する個数あるいは割合を、計測することによって、細胞の浸潤を定量的に評価する請求項33に記載の細胞評価手法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • CHIBA UNIVERSITY
  • Inventor
  • YAMADA MASUMI
  • SEKI MINORU
  • KITAGAWA YOICHI
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LT LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN TD TG
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