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METHOD OF INDUCING KIDNEY FROM PLURIPOTENT STEM CELLS

Foreign code F150008397
Posted date Jul 14, 2015
Country WIPO
International application number 2014JP077601
International publication number WO 2015056756
Date of international filing Oct 16, 2014
Date of international publication Apr 23, 2015
Priority data
  • P2013-217029 (Oct 18, 2013) JP
Title METHOD OF INDUCING KIDNEY FROM PLURIPOTENT STEM CELLS
Abstract The purpose of the present invention is to provide a process or method that can be utilized when deriving a three-dimensional structure of a kidney from pluripotent stem cells such as ES cells or iPS cells. This differentiation inducing method is characterized by culturing pluripotent cells with the following three steps, in order: (a) a step in which an embryoid body induced from the pluripotent stem cells is cultured in a culture medium that contains Bmp4 and a high-concentration (concentration A) Wnt agonist; (b) a step in which the embryoid body is cultured in a culture medium which contains activin, Bmp4, retinoic acid and a middle-concentration (concentration B) Wnt agonist; and (c) a step in which the embryoid body is cultured in a culture medium that contains Fgf9 and a low-concentration (concentration C) Wnt agonist (herein, the Wnt agonist concentrations satisfy concentration A > concentration B > concentration C).
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
哺乳動物由来の多能性幹細胞から後腎ネフロン前駆細胞を分化誘導する方法であって、該方法が、以下の3つの工程を、
(a)多能性幹細胞から誘導された胚様体を、Bmpおよび高濃度(濃度A)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、
(b)前記胚様体を、Bmpおよび中濃度(濃度B)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、および
(c)前記胚様体を、Fgfおよび低濃度(濃度C)のWntアゴニストを含有する培地で培養する工程、
をその順で含むことを特徴とする分化誘導方法
(ここで、Wntアゴニストの濃度は、濃度A>濃度B>濃度Cであって、濃度Aは濃度Cの少なくとも5倍である。)。
[請求項2]
前記工程(a)、(b)および(c)におけるWntアゴニストの濃度は、濃度Aは濃度Bの少なくとも3倍であり、かつ濃度Bは濃度Cの少なくとも3倍である、請求項1に記載の分化誘導方法。
[請求項3]
前記工程(b)において、培地がさらにアクチビンを含む、請求項1または2に記載の分化誘導方法。
[請求項4]
前記工程(b)において、培地がさらにレチノイン酸を含む、請求項3に記載の分化誘導方法。
[請求項5]
前記WntアゴニストがGSK-3阻害剤である(ただし、各工程のWntアゴニストは同じであっても異なってもよい)、請求項1~4のいずれかひとつに記載の分化誘導方法。
[請求項6]
前記Wntアゴニストが、CHIR99021、BIO、およびSB415286からなる群より選ばれる(ただし、各工程のWntアゴニストは同じであっても異なってもよい)、請求項5に記載の分化誘導方法。
[請求項7]
前記Bmpが、Bmp2、Bmp4およびBmp7からなる群より選ばれる、かつ、前記Fgfが、Fgf2、Fgf9およびFgf20からなる群より選ばれる、請求項1~6のいずれかに記載の分化誘導方法。
[請求項8]
前記BmpがBmp4であり、かつ前記FgfがFgf9である、請求項1~7のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[請求項9]
前記工程(a)、(b)および(c)におけるWntアゴニストが、CHIR99021であり、かつ、前記濃度Aが7.5μM~15μM、前記濃度Cが0.5μM~2.0μMである、請求項1~8のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[請求項10]
前記工程(a)および(b)におけるBmpがBmp4であり、工程(a)における濃度が0.1ng/ml~3ng/mlであり、工程(b)における濃度が1ng/ml~10ng/mlである、請求項9に記載の分化誘導方法。
[請求項11]
前記工程(b)において、アクチビンを2.5~40ng/mLの濃度で含む請求項10に記載の分化誘導方法。
[請求項12]
前記工程(a)、(b)および(c)が、連続した工程である請求項1~11のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[請求項13]
前記工程(c)において、培地が、Bmp、アクチビンまたはレチノイン酸のいずれも含まない培地である、請求項1~12のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[請求項14]
前記多能性幹細胞がマウスES細胞またはiPS細胞、またはヒトES細胞またはiPS細胞である、請求項1~13のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[請求項15]
前記多能性幹細胞がヒトiPS細胞である、請求項14に記載の分化誘導方法。
[請求項16]
前記多能性幹細胞がマウスES細胞またはiPS細胞であり、かつ工程(a)が、少なくとも1日以上4日以内培養する工程である請求項14に記載の分化誘導方法。
[請求項17]
前記多能性幹細胞がヒトES細胞またはiPS細胞であり、かつ工程(a)が、少なくとも3日以上11日以内培養する工程である請求項14に記載の分化誘導方法。
[請求項18]
転写因子である、Osr1、Wt1、Pax2、Six2、Hoxa10、Hoxa11の全てを発現する細胞集団であることを特徴とする哺乳動物由来の多能性幹細胞から分化誘導されたネフロン前駆細胞。
[請求項19]
前記多能性幹細胞が、マウスES細胞またはiPS細胞、またはヒトES細胞またはiPS細胞である、請求項18に記載のネフロン前駆細胞。
[請求項20]
請求項1~17のいずれか一つに記載の分化誘導方法により誘導されたネフロン前駆細胞。
[請求項21]
請求項18~20のいずれか一つに記載のネフロン前駆細胞を用いて、糸球体および尿細管を有する三次元腎臓構造を作成する方法。
[請求項22]
前記方法が、ネフロン前駆細胞を気液界面にて胚脊髄またはWnt4発現細胞と共培養ことを含む、請求項21に記載の三次元腎臓を作成する方法。
[請求項23]
請求項21または22に記載の方法により形成された、糸球体および尿管を有する三次元腎臓構造。
[請求項24]
請求項18~20のいずれか一つに記載のネフロン前駆細胞から分化誘導されたCadherin6、Megalin、およびLTLを発現する細胞集団であることを特徴とする近位尿細管細胞。
[請求項25]
前記分化誘導が、ネフロン前駆細胞を胎児脊髄またはWnt4発現細胞と共培養することにより行われる、請求項24に記載の近位尿細管細胞。
[請求項26]
請求項18~20のいずれか一つに記載のネフロン前駆細胞から分化誘導された、E-cadherin、Brn1、およびNCCを発現する細胞集団であることを特徴とする遠位尿細管細胞。
[請求項27]
前記分化誘導が、ネフロン前駆細胞を胎児脊髄またはWnt4発現細胞と共培養することにより行われる、請求項26に記載の遠位尿細管細胞。
[請求項28]
請求項18~20のいずれか一つに記載のネフロン前駆細胞から分化誘導された、Wt1、Nephrin、およびPodocinを発現する細胞集団であることを特徴とする糸球体上皮細胞。
[請求項29]
前記分化誘導が、ネフロン前駆細胞を胎児脊髄またはWnt4発現細胞と共培養することにより行われる、請求項28に記載の糸球体上皮細胞。
[請求項30]
多能性幹細胞からネフロン前駆細胞を誘導するための分化誘導培地キットであって、該キットは、(i)分化誘導培地、および(ii)Wntアゴニストを含み、使用時において、前記Wntアゴニストを段階的濃度で含む少なくとも3つの分化誘導培地が調整される、ここで、前記段階的濃度は、少なくとも濃度A、BおよびCからなり、濃度A>濃度B>濃度Cであって、濃度Aは濃度Cの少なくとも5倍である、
ことを特徴とする培地キット、培地キット。
[請求項31]
前記Wntアゴニストの段階的濃度は、濃度Aは濃度Bの少なくとも3倍であり、かつ濃度Bは濃度Cの少なくとも3倍であるように分化誘導培地が調整される、請求項30に記載の培地キット。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • KUMAMOTO UNIVERSITY
  • Inventor
  • NISHINAKAMURA RYUICHI
  • TAGUCHI ATSUHIRO
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN TD TG
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