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PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT OF INFLAMMATORY BOWEL DISEASE

外国特許コード F150008468
掲載日 2015年10月22日
出願国 世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）
国際出願番号 2014JP054778
国際公開番号 WO 2014148216
国際出願日 平成26年2月14日(2014.2.14)
国際公開日 平成26年9月25日(2014.9.25)
優先権データ
  • 特願2013-057341 (2013.3.19) JP
発明の名称 （英語） PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATMENT OF INFLAMMATORY BOWEL DISEASE
発明の概要（英語） The purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for the treatment of inflammatory bowel disease and a treatment method therefor. A pharmaceutical composition containing siRNA inhibiting the expression of a CD98 heavy chain was found to be useful in the treatment of inflammatory bowel disease. As a result, a novel treatment method can be provided that uses the siRNA for inflammatory bowel disease for which there has conventionally been no appropriate treatment method.
  • 出願人（英語）
  • ※2012年7月以前掲載分については米国以外のすべての指定国
  • THE UNIVERSITY OF TOKUSHIMA
  • 発明者（英語）
  • YASUTOMO KOJI
国際特許分類(IPC)
指定国 National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LT LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN TD TG

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発明の名称 炎症性腸疾患の治療用医薬組成物
発明の概要 本発明は、炎症性腸疾患の治療用医薬組成物と治療法を提供することを目的とする。　ＣＤ９８重鎖を発現抑制するｓｉＲＮＡを含有する医薬組成物が、炎症性腸疾患の治療に有用であることを見出した。その結果、これまで適切な治療方法がなかった炎症性腸疾患に上記ｓｉＲＮＡを使用する新たな治療方法が提供できるようになった。
特許請求の範囲 [請求項1]
ＣＤ９８重鎖の発現を抑制する機能性核酸を有効成分とする、炎症性腸疾患の治療用医薬組成物。
[請求項2]
上記機能性核酸がｓｉＲＮＡである、請求項１記載の医薬組成物。
[請求項3]
上記炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎又はクローン病である、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
[請求項4]
上記ｓｉＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである、請求項２に記載の医薬組成物。
[請求項5]
上記二本鎖ＲＮＡが、配列番号１と配列番号２、配列番号３と配列番号４、あるいは配列番号５と配列番号６の一つ以上を含有するｓｉＲＮＡである、請求項４に記載の医薬組成物。
[請求項6]
上記二本鎖ＲＮＡが、配列番号７と配列番号８、配列番号９と配列番号１０、あるいは配列番号１１と配列番号１２の一つ以上を含有するｓｉＲＮＡである、請求項４に記載の医薬組成物。
[請求項7]
配列番号１と配列番号２、配列番号３と配列番号４、あるいは配列番号５と配列番号６のいずれかの配列を有する二本鎖ｓｉＲＮＡ。
[請求項8]
二本鎖ＲＮＡ部分が、配列番号７と配列番号８、配列番号９と配列番号１０、あるいは配列番号１１と配列番号１２のいずれかの配列を有する二本鎖ｓｉＲＮＡ。
[請求項9]
哺乳類に、ＣＤ９８重鎖の発現を抑制する機能性核酸を有効量投与することを特徴とする炎症性腸疾患の治療方法。
[請求項10]
上記機能性核酸が、ｓｉＲＮＡである、請求項９記載の治療方法。
[請求項11]
上記ｓｉＲＮＡが、請求項７または８に記載の２本鎖ｓｉＲＮＡである、請求項１０に記載の治療方法。
[請求項12]
上記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎又はクローン病である、請求項９~１１のいずれかに記載の治療方法。
明細書
明　細　書 発明の名称 : 炎症性腸疾患の治療用医薬組成物

技術分野

[0001]

本発明は、炎症性腸疾患（潰瘍性大腸炎及び／又はクローン病）に対する新規治療剤に関するものである。より詳細には、本発明は、ＣＤ９８のｓｉＲＮＡを中心とする、ＣＤ９８の機能性核酸を有効成分とする潰瘍性大腸炎及び／又はクローン病の治療用医薬組成物に関するものである。

背景技術

[0002]

潰瘍性大腸炎は、１９７０年代に特定疾患（難病）として指定されたかなり希少な疾患であり、原因が不明なため、対症療法的な治療が多く、治療方法としては確立できていない状況である。しかしながら、最近、患者数は急増しており、１９８５年には１万人超であったが、２００２年には、７万７０００人となり、２００８年には１０万人を超えている（厚生労働省調べ）。そして、患者の発症率に性別の差はなく、発症年齢もあらゆる年代に分布しているが、３０歳代をピークに２０~５０歳代に多く分布している。

クローン病も、潰瘍性大腸炎と同様に、消化管に原因不明の潰瘍を発症する疾患であり、２０才台の若年者に多く見られる慢性の炎症疾患である。クローン病も潰瘍性大腸炎と同様に、最近患者数が増加している。クローン病も潰瘍性大腸炎と同様に厚生労働省により特定疾患治療研究対象疾患に指定されており、潰瘍性大腸炎と似ている点も多く、２つをまとめて炎症性腸疾患と呼ばれている。

これら炎症性腸疾患の原因は、遺伝的要因とそれに基づく腸管での異常な免疫反応のためとする説もあるが、疾患の原因はまだ解明されていない。患者数の増加は、食生活の欧米化によるものと言われており、その原因の一つとして、食物中の物質や微生物が抗原となって異常反応を引き起こすと考えられている。

上記炎症性腸疾患の治療のために、現在、幾つかの治療方法が報告されている。例えば、ｓｉＲＮＡを使用する治療方法としては、腫瘍壊死因子受容体２（ＴＮＦＲ２）のｓｉＲＮＡを使用して、ＴＮＦＲ２の発現を抑制し、炎症性腸疾患の治療を行うことが報告されている（特許文献１）。あるいは、ｓｉＲＮＡを使用して、アポトーシス因子５Ａ１（ｅｌＦ５Ａ）の発現を抑制することにより、炎症促進性サイトカインの発現を抑制し、炎症性腸疾患の治療を行うことが報告されている（特許文献２）。更には、インターロイキン１２の４０ｋＤａサブユニット及び／又は３５ｋＤａの発現を阻害し、インターロイキン１２の発現抑制により、炎症性腸疾患、特にクローン病の治療を行うことが報告されている（特許文献３）。

しかしながら、炎症性腸疾患の原因が様々に予想される中、まだ、的確な治療方法と考えられるものは、見出されていない現状である。

先行技術文献 特許文献

[0003]

特許文献1 : 特表２０１２－５３１２０４号公報

特許文献2 : 特開２０１１－２６３４３号公報

特許文献3 : 特表２００８－５３２５４０号公報

発明の概要 発明が解決しようとする課題

[0004]

本発明は、ＣＤ９８の機能性核酸による炎症性腸疾患の治療用医薬組成物の提供を目的とする。特に、ＣＤ９８重鎖の発現を抑制するｓｉＲＮＡを有効成分とする炎症性腸疾患の治療用医薬組成物の提供を目的とする。

課題を解決するための手段

[0005]

本発明者は、アミノ酸輸送に係るＣＤ９８に着目し、ＣＤ９８重鎖の発現を抑制するｓｉＲＮＡを用いて、その作用効果を検討して来た。まず、ＣＤ９８の重鎖に対するｓｉＲＮＡを用いて、糖尿病ＮＯＤマウスの治療を行なったところ、上記ｓｉＲＮＡが１型糖尿病の進行を抑制すると共に、１型糖尿病を治療できることを見出している（ＰＣＴ／ＪＰ２０１２／０７５５８７）。即ち、作用機序は明瞭ではないが、膵臓β細胞のアポトーシスに基づく１型糖尿病に対して、本抗体が非常に有効であることが示された。更に関節リウマチにも、本発明のｓｉＲＮＡは有効であることが示されている。このことから、本発明のＣＤ９８のｓｉＲＮＡは、１型糖尿病や関節リュウマチの原因と考えられる自己免疫疾患に有効と考えられた。そこで、本発明者らは、本発明のｓｉＲＮＡを使用して、自己免疫疾患の可能性が高い炎症性腸疾患の治療を検討した。その結果、ラットの炎症性腸疾患モデルにおいても、図３と図４に示すように、炎症性腸疾患を治療できることを見出した。

本発明者は、以上の知見に基づいて本発明を完成した。

すなわち本発明は以下のとおりである。

（１）ＣＤ９８重鎖の発現を抑制する機能性核酸を有効成分とする、炎症性腸疾患の治療用医薬組成物。

（２）上記機能性核酸がｓｉＲＮＡである、上記（１）に記載の医薬組成物。

（３）上記炎症性腸疾患が潰瘍性大腸炎又はクローン病である、上記（１）又は（２）に記載の医薬組成物。

（４）上記ｓｉＲＮＡが二本鎖ＲＮＡである、上記（２）に記載の医薬組成物。

（５）上記二本鎖ＲＮＡが、配列番号１と配列番号２、配列番号３と配列番号４、あるいは配列番号５と配列番号６の一つ以上を含有するｓｉＲＮＡである、上記（４）に記載の医薬組成物。

（６）上記二本鎖ＲＮＡが、配列番号７と配列番号８、配列番号９と配列番号１０、あるいは配列番号１１と配列番号１２の一つ以上を含有するｓｉＲＮＡである、上記（４）に記載の医薬組成物。

（７）配列番号１と配列番号２、配列番号３と配列番号４、あるいは配列番号５と配列番号６のいずれかの配列を有する二本鎖ｓｉＲＮＡ。

（８）二本鎖ＲＮＡ部分が、配列番号７と配列番号８、配列番号９と配列番号１０、あるいは配列番号１１と配列番号１２のいずれかの配列を有する二本鎖ｓｉＲＮＡ。

（９）哺乳類に、ＣＤ９８重鎖の発現を抑制する機能性核酸を有効量投与することを特徴とする炎症性腸疾患の治療方法。

（１０）上記機能性核酸が、ｓｉＲＮＡである、上記（９）に記載の治療方法。

（１１）上記ｓｉＲＮＡが、上記（７）または（８）の２本鎖ｓｉＲＮＡである、上記（１０）に記載の治療方法。

（１２）上記炎症性腸疾患が、潰瘍性大腸炎又はクローン病である上記（９）~（１１）のいずれかに記載の治療方法。

発明の効果

[0006]

本発明によれば、ＣＤ９８重鎖の発現を抑制する機能性核酸を投与することにより、炎症性腸疾患に対する高い治療効果を得ることができる。そのため、本発明のｓｉＲＮＡを使用すれば、これまで効果的な治療方法のなかった、炎症性腸疾患の有効な治療方法となることができる。

図面の簡単な説明

[0007]

図１は１型糖尿病を発症したＮＯＤマウスのＴ細胞を重症複合型免疫不全症のＮＯＤモデルマウス（ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス）に投与する。投与後のマウスに、ＣＤ９８重鎖に対するマウスｓｉＲＮＡ（４ｎｍｏｌ／ｍｏｕｓｅ）、あるいはコントロールのｓｉＲＮＡを、２日目、５日目、８日目に投与する。なお、Ｔ細胞を投与した日を起算日とする。

図１は、３日後の末梢血単核球細胞のＣＤ９８重鎖の発現をフローサイトメトリーで評価した図である。灰色（ＧＲＡＹ）の部分は、ＣＤ９８抗体を投与した場合の測定結果である。点線部分は、コントロールのｓｉＲＮＡを投与した場合の測定結果であり、実線部分は、ＣＤ９８重鎖に対するｓｉＲＮＡを投与した場合の測定結果を示している。即ち、本発明のｓｉＲＮＡは、ＷＯ２０１１／１１８８０４に記載の抗ＣＤ９８抗体と同じ効果を示すことが示されている。

図２はマウスを用いた炎症性腸疾患モデルの作成方法と、本発明のｓｉＲＮＡの投与スケジュールを表わした図である。

図３は炎症性腸疾患モデルマウスを使用し、ｓｉＲＮＡを１日目、３日目、５日目、７日目に４回腹腔内投与した場合の、ラットの体重変化を表わした図である。マウスｓｉＲＮＡの投与により、炎症性腸疾患の発症が抑制され、体重減少が抑制されている。

図４は炎症性腸疾患モデルマウスの、臨床スコアと組織学的スコアを評価した図である。マウスｓｉＲＮＡの投与により、臨床スコアおよび組織学的スコアの両者が抑制されている。

図５はヒトＴリンパ腫由来のＪｕｒｋａｔ細胞に対してヒトｓｉＲＮＡを投与し、細胞表面におけるＣＤ９８タンパクの発現の変化を、フローサイトメーターで測定、評価した図である。無処置群、コントロールｓｉＲＮＡ投与群と比較し、ヒトｓｉＲＮＡを投与することにより、ＣＤ９８タンパクの発現の抑制が大きく抑制されたことを示している。

図６は炎症性腸疾患モデルマウスを使用し、マウス抗ＣＤ９８抗体を０日目から３日おきに５回腹腔内投与した。なお、コントロールとして、ラットＩｇＧを使用した。その場合の、マウスの体重変化を表わした図である。マウス抗ＣＤ９８抗体の投与により、炎症性腸疾患の発症が抑制され、体重減少が抑制されている。以上のように、本発明のｓｉＲＮＡの効果は、抗ＣＤ９８抗体によっても同様に検証されている。

図７は炎症性腸疾患モデルマウスの、臨床スコアと組織学的スコアを評価した図である。マウス抗ＣＤ９８抗体の投与により、臨床スコアおよび組織学的スコアの両者が抑制されている。以上のように、本発明のｓｉＲＮＡの効果は、抗ＣＤ９８抗体によっても同様に検証されている。

発明を実施するための形態

[0008]

本発明の一つの態様は、「ＣＤ９８重鎖の発現を抑制する機能性核酸を有効成分とする炎症性腸疾患の治療用医薬組成物」に関するものである。ここで「ＣＤ９８」は公知のタンパク質であり、ＤＮＡ配列とアミノ酸配列は、特開２００９－１８９３７６号公報に記載されている。本発明における「ＣＤ９８」は、これらの配列に限定されるものではなく、ＣＤ９８の機能が保持される限り、アミノ酸やＤＮＡの変異数や変異部位には制限はないものとする。

なお、ＣＤ９８とは、細胞膜上に幅広く発現している約１２０ｋＤａのヘテロ２量体の糖タンパク質であり、アミノ酸輸送、増加した細胞膜発現とインテグリンが仲介する接着に付随する細胞融合に関連すると考えられている。ＣＤ９８の構造は、約８０ｋＤａＩＩ型膜貫通型タンパク質ＣＤ９８ｈｃ（重鎖：４Ｆ２ｈｃ、ＳＬＣ３Ａ２）と６種類ある約４０ｋＤａの軽鎖（ＬＡＴ１，ＬＡＴ２，ｙ＋ＬＡＴ１，ｙ＋ＬＡＴ２，ｘＣＴ，ａｓｃ）の１つとジスルフィド結合によるヘテロ２量体を構成し、アミノ酸トランスポーターとして機能している。ＣＤ９８の重鎖（ＣＤ９８ｈｃ）は細胞膜に２量体を移動させる役割を持ち、軽鎖（ｌｃ）がトランスポーターの機能を持つと考えられている。

また、ＣＤ９８重鎖は、上皮細胞の血管側の細胞膜に存在し、上記のトランスポーターを上皮細胞の血管側の細胞膜へ移送する働きをしている。

そのため、一般的には、ＣＤ９８重鎖の発現を抑制すると、ＣＤ９８（重鎖と軽鎖の複合体）のアミノ酸輸送が抑制されると考えられたが、本発明のＣＤ９８の重鎖に対するｓｉＲＮＡの場合には、アミノ酸輸送をあまり抑制するようには見えなかった。

本発明において「機能性核酸」とは、タンパク質の発現を抑制できる機能を持ったｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アプタマー、リボザイム、アンチセンス核酸のことを言う。好ましいものとしては、ｓｉＲＮＡを挙げることができる。即ち、本発明のｓｉＲＮＡとは、ＣＤ９８重鎖の遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡをさす。具体的には、対照群（コントロールｓｉＲＮＡを使用した場合）と比較してＣＤ９８の遺伝子発現を５０％以上抑制できるｓｉＲＮＡを、好ましくは８０％以上抑制できるｓｉＲＮＡをいう。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉と呼ばれる配列特異的な遺伝子発現の抑制を誘導することが知られている。ｓｉＲＮＡは、一般的に二本鎖のＲＮＡ部分と、センス鎖およびアンチセンス鎖の３’末端のオーバーハング部分から構成される。ｓｉＲＮＡは、当業者にとって公知の方法によって設計することができる。例えば、選択したＤＮＡ配列（１９~２１塩基が望ましい）をそのままＲＮＡ配列に変換したもの（センス鎖）とそのアンチセンス鎖を二本鎖ＲＮＡ部分とし、オーバーハング部を付加する。オーバーハング部は、１又は２塩基の任意の核酸（リボ核酸またはデオキシ核酸）であるが、ウリジン（Ｕ）もしくはチミジン（ｄＴ）が好ましい。本発明のｓｉＲＮＡは、ＣＤ９８、好ましくはヒトのＣＤ９８重鎖のＤＮＡ配列に基づいて設計され、ＣＤ９８重鎖の発現を抑制できるｓｉＲＮＡであれば、特に限定されるものではない。発現の抑制は、ＣＤ９８重鎖に特異的であることが望ましい。特異的であるかどうかは、一般公開されているＢＬＡＳＴ検索を実施することにより確認できる。またオーバーハング部分は必須ではない。

また本発明のｓｉＲＮＡには、投与対象内で本発明のｓｉＲＮＡと同じ効果を有する任意の分子も含まれる。このような分子としては、例えば、ｓｈＲＮＡが挙げられる。ｓｈＲＮＡとはショートヘアピン構造型のＲＮＡであり、一本鎖の一部の領域が他の領域と相補鎖を形成するためにステムループ構造を有するＲＮＡ分子である。二本鎖ＲＮＡ部分が、本発明のｓｉＲＮＡと同一構造を有するｓｈＲＮＡも本発明のｓｉＲＮＡに含まれる。他には、投与対象に投与することによって本発明のｓｉＲＮＡを発現することができるようなＤＮＡも本発明のｓｉＲＮＡに含まれる。このようなＤＮＡは、ｓｉＲＮＡをコードするＤＮＡを発現ベクター（例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスなどのベクター）に組み込んで構築して使用される。

本発明において、機能性核酸を医薬組成物として使用する場合には、治療薬としての特性を改善するための修飾、あるいはリポソームなどの輸送担体に含包することが望ましい。ポリヌクレオチドの治療薬としての特性を改善するには、ヌクレオチドの修飾または類似体を導入することができる。例えば、ヌクレアーゼ耐性の向上および／または細胞透過性の向上などである。ヌクレアーゼ耐性は、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはリボザイムの生理活性を妨げないような技術上周知の任意の方法によりもたらされる。ヌクレアーゼ耐性の向上を目的にオリゴヌクレオチドに加えることができる修飾の例としては、リン酸骨格中のヘテロ原子のリンまたは酸素の修飾である。例えば、メチルリン酸、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、およびモルホリノオリゴマーなどである。また、技術上周知の他の修飾により、生理活性は維持したまま、ヌクレアーゼに対する安定性を大幅に高めるようにしてもよい。

更に、本発明において機能性核酸を医薬組成物や治療方法として使用する場合には、機能性核酸そのものを治療に用いる方法と、ベクターを用いて機能性核酸を発現させて治療に用いる方法が存在する。

機能性核酸そのものを治療に用いる場合には、アテロコラーゲン等の安定化剤、ｐＨ調節剤などを添加した水溶液を作製し、そのまま非経口で投与することが望ましい。

ベクターを用いてｉｎ　ｖｉｖｏ発現を行なう場合には、特に本発明の治療を必要とする患者体内での発現に際しては、発現ベクター、特に哺乳動物発現ベクターを使用するのが望ましい。発現ベクターは技術上周知であり、好ましくはプラスミド、コスミド、ウイルス発現系を含む。好ましいウイルス発現系の例としてはアデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスなどである。また細胞や組織にベクターを導入する方法は技術上周知である。好ましい例としては、トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、および組み換えウイルスベクターによる感染などである。

本発明の「哺乳動物」とは、例えばラット、マウス、モルモット等のげっ歯類、例えばイヌやネコ、更には例えばヒトやサルの霊長類を挙げることができる。

本発明の「炎症性腸疾患」とは、例えば潰瘍性大腸炎又はクローン病を挙げることができる。

本発明の２つ目の態様は、「ＣＤ９８重鎖の発現を抑制する機能性核酸を有効量投与することを特徴とする自己免疫疾患の治療方法」に関するものである。

本発明の医薬組成物を用いて、炎症性腸疾患を治療する際には、上記の機能性核酸と共に、通常の製剤学的に許容しうる１又は２種以上の製剤用添加物を用いて医薬組成物を製造して投与することが好ましい。本発明の医薬組成物の投与方法は非経口投与が望ましく、静脈投与、筋肉内投与、腹腔内投与、または皮下投与などを行うことができる。

本発明の機能性核酸の投与量は、投与対象、投与方法等により異なるが、例えば非経口投与する場合は、自己免疫疾患の患者（６０ｋｇ）に対して、例えば、一日約０．０１~３０ｍｇ、好ましくは約０．１~２０ｍｇ、より好ましくは約０．１~１０ｍｇを静脈注射することができる。

なお、本発明の態様で、前項と共通に使用される用語は、前項と同じ意味を表わすものとする。

実施例

[0009]

以下に実施例を挙げて本発明を説明するが、実施例は本発明をより良く理解するために例示するものであって、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されることを意図するものではない。

（実施例１）本発明のＣＤ９８重鎖の発現抑制用のｓｉＲＮＡと、ＣＤ９８の重鎖に対する抗ＣＤ９８抗体（ＷＯ２０１１／１１８８０４）との対比試験

１）実験材料：

ａ）動物：

１型糖尿病モデルマウス（ＮＯＤマウス）：ＮＯＤ－ＳＣＩＤマウスは、日本ＳＬＣ社（浜松、日本）から購入した。すべてのマウスは徳島大学の動物センター内で無菌条件下で飼育され、すべての実験は動物の管理と利用のガイドラインに則って実施された。

ＮＯＤマウスの糖尿病発症状況は、このマウスの尿中の糖濃度と空腹時の血糖値を一週間毎に測定してモニターした。２５０ｍｇ／ｄｌ以上の血中濃度を持つマウスが糖尿病であるとした。ＮＯＤの雌性マウスが２０~２５週令になると８０％以上の割合で、１型糖尿病になる。

ｂ）フローサイトメトリー：

脾臓、膵臓リンパ節、膵臓から得られるリンパ球は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲＶα２とＴＣＲＶβ５に対する蛍光色素の結合抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、ＵＡＳ）で染色された。幾つかの実験では、細胞をメモンシンの存在下、２５０ｎｇ／ｍｌのＰＭＡ（シグマ社）と１μｇ／ｍｌのイオノマイシン（シグマ社）で５時間刺激し、ＣＤ４又はＣＤ８用の表面染色をした。更に、グランザイムＢ、ＩＦＮ－γ又はＩＬ－１７用の細胞内染色をした。７－アミノアクチノマイシンＤ（シグマ社）は、死細胞を除くために使用された。

実験操作は、マニュアルに則って実施した。データは、ＦＡＣＳのコントロール下で集計され、ＦｌｏｗＪｏソフト（スリースター、米国）を使用して行った。

ｃ）マウスｓｉＲＮＡ：

ＣＤ９８重鎖の発現抑制用の下記表１の３種のマウスｓｉＲＮＡの混合物、又は標的遺伝子を持たないコントロールのｓｉＲＮＡ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ社）を作製し、使用した。

[表1]

２）方法：

上記ＣＤ９８重鎖の発現抑制用の３種のｓｉＲＮＡの混合物、又は標的遺伝子を持たないコントロールのｓｉＲＮＡとアテロコラーゲン（高研、日本）とを実験手順書に従い混合し、ｓｉＲＮＡ溶液を調製した。

糖尿病ＮＯＤマウスのＴ細胞が投与された重症複合型免疫不全症モデルマウス（ＳＣＩＤマウス）に、上記ｓｉＲＮＡ溶液を４ｎｍｏｌ／マウスになるように腹腔内投与した。ｓｉＲＮＡの投与スケジュールは、２日目、５日目と８日目である。なお、Ｔ細胞が投与された日を起算日とする。上記ｓｉＲＮＡ溶液の投与後３日目に、血液を採取し、白血球を単離して、抗マウスＣＤ９８抗体で染色して、フローサイトメトリーで評価した。

３）結果：

フローサイトメトリーでの評価結果を図１に示す。灰色（ＧＲＡＹ）の部分は、抗ＣＤ９８抗体を投与した場合の測定結果である。点線部分は、コントロールのｓｉＲＮＡを投与した場合の測定結果であり、実線部分は、ＣＤ９８重鎖に対するｓｉＲＮＡを投与した場合の測定結果を示している。

この結果は、本発明のＣＤ９８重鎖をターゲットとするｓｉＲＮＡが、ＣＤ９８重鎖をターゲットとする抗ＣＤ９８抗体と同じように使用できることを示している。

（実施例２）ＣＤ９８重鎖の発現抑制用のｓｉＲＮＡによる炎症性腸疾患の進行抑制試験

１）実験材料：

炎症性腸疾患モデルマウスの作製：

ＤＢＡ／１Ｊマウス（７週齢の雌、１０匹）のそれぞれ２群に分け、図２に示すようにマウスＣＤ９８に対するｓｉＲＮＡを投与した。

２）方法：

ＳＣＩＤマウス（雌性）にＢＡＬＢ／ｃマウス（雌性）の脾臓から採取した、ＣＤ４陽性ＣＤ２５陰性Ｔ細胞（１　ｘ　１０６／マウス）を移入した。Ｔ細胞を移入した日を起算日として、実施例１に記載の３種のｓｉＲＮＡ混合溶液を４ｎｍｏｌ／マウスになるように腹腔内投与した。ｓｉＲＮＡの投与スケジュールは、１日目、３日目、５日目、７日目と４回のｓｉＲＮＡの投与を行った。

なお、ｓｉＲＮＡ混合溶液は、実施例１に記載のようにｓｉＲＮＡをアテロコラーゲンと用事調整で混合し、作製後直ちにマウスに投与した。

３）結果：

上記の炎症性腸疾患モデルマウス（ＳＣＩＤマウス）にＣＤ９８重鎖のｓｉＲＮＡを投与したところ、図３に示すように、炎症性腸疾患の進行を抑制でき、体重減少を抑制できることが分かった。

以上のように、ＣＤ９８重鎖をターゲットとするｓｉＲＮＡを用いて、炎症性腸疾患を治療できることを明らかにした。

また、図４に示されるように、マウスｓｉＲＮＡの投与により、臨床スコアおよび組織学的スコアの両者が抑制されると言うことが明らかになった。

（実施例３）ＣＤ９８重鎖の発現抑制用のｓｉＲＮＡによるヒト白血病Ｔ細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）のＣＤ９８発現進行抑制試験

１）実験材料：

・Ｊｕｒｋａｔ細胞：　ヒトＣＤ９８タンパクを高発現するＪｕｒｋａｔ細胞をＡＴＣＣから購入した。

・トランスフェクション試薬（ＦｕＧＥＮＥ８）：非リポソーム系トランスフェクション試薬であるＦｕＧＥＮＥ８をロシュ・アプライド・サイエンス社から購入した。

・ヒトｓｉＲＮＡ：

ＣＤ９８重鎖の発現抑制用の下記表２の３種のヒトｓｉＲＮＡの混合物のｓｉＲＮＡを作製（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ社に依頼）し、使用した。

[表2]

２）方法：

Ｊｕｒｋａｔ細胞にＣＤ９８に対して上記ヒトｓｉＲＮＡを使用し、Ｆｕｇｅｎｅ８をつかって遺伝子導入し、２日後に細胞表面上のＣＤ９８発現をＦＩＴＣ標識したヒトＣＤ９８抗体を用いて、フローサイトメーターで測定し、非処理を１００としたときの発現量を測定した。

３）結果：

Ｊｕｒｋａｔ細胞表面におけるＣＤ９８発現の比率をフローサイトメーターにより測定、評価し、その結果を図５に示す。図５に示されるように、コントロールｓｉＲＮＡ投与群では、ＣＤ９８のタンパク発現は非処理群と同じであった。しかし、ヒトｓｉＲＮＡの投与群では、ＣＤ９８のタンパク発現が約７５％抑制された。

以上のことは、これらの３種のヒトｓｉＲＮＡを使用して、炎症性腸疾患の治療ができることを示している。

（試験例１）ＣＤ９８重鎖に対する抗ＣＤ９８抗体による炎症性腸疾患の進行抑制試験

１）実験材料と方法：

実施例２の結果を検証するため、同様に炎症性腸疾患モデルマウス（ＳＣＩＤマウス、８週令、雌性）を作製した。Ｔ細胞を移入した日を起算日として、マウス抗ＣＤ９８抗体（ＷＯ２０１１／１１８８０４に記載、２００μｇ／回）を移入日から３日おきに５回投与した。なお、コントロールとして、ラットＩｇＧを使用した。

２）結果：

Ａ：体重増加率：

図６に示すように、実施例２のＣＤ９８ｓｉＲＮＡと同様に、マウス抗ＣＤ９８抗体を用いても、炎症性腸疾患の進行を抑制でき、体重減少が抑制できた（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１）。

Ｂ：臨床スコアおよび組織学的スコアの平均：

図７に示すように、マウス抗ＣＤ９８抗体を用いても炎症性腸疾患の進行を抑制でき、臨床スコアおよび組織学的スコアの両者が抑制され、実施例２のＣＤ９８ｓｉＲＮＡを用いた場合と同じ結果を得た。

以上のように、実施例２のｓｉＲＮＡの効果は、抗ＣＤ９８抗体によっても同様に検証されている。

産業上の利用可能性

[0010]

本発明の炎症性腸疾患の治療用医薬組成物は、ｓｉＲＮＡによるＣＤ９８の重鎖の発現抑制という新たな作用機序により、これまで適切な治療方法がなかった炎症性腸疾患の治療を可能にするものである。
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