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METHOD FOR ANALYSIS FOR 3-HYDROXYPROLINE, METHOD FOR EXAMINING COLLAGEN, AND NOVEL Δ1-PYRROLINE-2-CARBOXYLIC ACID REDUCTASE FOR USE THEREIN

Foreign code F150008507
File No. S2013-0983-C0
Posted date Nov 5, 2015
Country WIPO
International application number 2014JP065019
International publication number WO 2015033636
Date of international filing Jun 5, 2014
Date of international publication Mar 12, 2015
Priority data
  • P2013-186647 (Sep 9, 2013) JP
Title METHOD FOR ANALYSIS FOR 3-HYDROXYPROLINE, METHOD FOR EXAMINING COLLAGEN, AND NOVEL Δ1-PYRROLINE-2-CARBOXYLIC ACID REDUCTASE FOR USE THEREIN
Abstract The purpose of the present invention is to provide a new analytical method which renders simple analysis for 3-hydroxyproline possible. A sample to be examined is analyzed for 3-hydroxyproline through the following steps (s1) to (s3): (s1) a dehydration step in which the 3-hydroxyproline contained in the sample to be examined is dehydrated into Δ1 -pyrroline-2-carboxylic acid by the action of a 3-hydroxyproline dehydratase; (s2) a reduction step in which the Δ1 -pyrroline-2-carboxylic acid obtained in step (s1) is hydrogenated by the action of a Δ1 -pyrroline-2-carboxylic acid reductase; and (s3) an analysis step in which the reduction reaction in step (s2) is analyzed.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
In recent years, from the viewpoint of health and cosmetically, attracted attention and is collagen, a quantitative analysis and qualitative analysis of collagen, has been regarded as important.
As an analysis method of collagen in the sample, and measuring the content of hydroxyproline contained in the collagen by, a method of measuring indirectly generally collagen. Collagen, general protein, non-collagenous proteins that do not correspond to the amino acid is a basic element containing hydroxyproline. For this reason, can analyze the hydroxyproline in the sample, indirectly, of collagen in the sample analysis can be made. Then, measurement of hydroxyproline, a general-purpose analysis HPLC (patent document 1). As a specific method is, first, the pre-processing the sample, by the degradation of the collagen to liberate hydroxyproline. The pre-processed sample was subjected to HPLC, to calculate the amount of hydroxyproline from the peak area of hydroxyproline. Then, and the calculated value, and the amount of hydroxyproline per molecule collagen 1, the amount of collagen in the sample can be obtained.
When analyzing HPLC analysis hydroxyproline, hydroxyproline, liberated by the degradation of the collagen must be separated from the hydroxyproline L -. However, analyzed by HPLC, and the separation of hydroxyproline and hydroxyproline L -, difficult. In addition, hydroxyproline may be a primary amine 2, special developing solvent and the ring-opening is necessary. Further, HPLC analysis, and the analytical column and the required device expensive, a problem that time is required for the analysis.
On the other hand, among them collagen, collagen IV is, the concentration in the urine of cancer patients and reported to be elevated, which may be a marker for cancer. Then, the collagen IV, other types (for example, I-III) compared to, hydroxyproline is about 8-25 times from the contained 3 -, 3 - by analyzing hydroxyproline, collagen IV and indirectly a cancer marker can be analyzed. For this reason, a simple analysis of hydroxyproline 3 - is able to be demanded.
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲 [請求項1]
下記(s1)~(s3)工程を含むことを特徴とする、被検試料中の3-ヒドロキシプロリンを分析する分析方法。
(s1)3-ヒドロキシプロリン脱水酵素により、被検試料中の3-ヒドロキシプロリンをΔ 1-ピロリン-2-カルボン酸に脱水する脱水工程
(s2)Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素により、前記(s1)工程において得られたΔ 1-ピロリン-2-カルボン酸を水素化する還元工程
(s3)前記(s2)工程の還元反応を分析する分析工程

[請求項2]
前記(s2)工程のΔ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素が、下記(R1 Tl)~(R3 Tl)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項1記載の分析方法。
(R1 Tl) 配列番号14のアミノ酸配列からなるタンパク質
(R2 Tl) 前記(R1 Tl)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
(R3 Tl) 前記(R1 Tl)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質

[請求項3]
前記(s2)工程のΔ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素が、下記(R1 Ab)~(R3 Ab)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項1記載の分析方法。
(R1 Ab) 配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質
(R2 Ab) 前記(R1 Ab)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
(R3 Ab) 前記(R1 Ab)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質

[請求項4]
前記(s2)工程のΔ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素が、下記(R1 Cp)~(R3 Cp)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項1記載の分析方法。
(R1 Cp) 配列番号13のアミノ酸配列からなるタンパク質
(R2 Cp) 前記(R1 Cp)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
(R3 Cp) 前記(R1 Cp)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質

[請求項5]
前記(s2)工程のΔ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素が、下記(R1 Ps)~(R3 Ps)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項1記載の分析方法。
(R1 Ps) 配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質
(R2 Ps) 前記(R1 Ps)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
(R3 Ps) 前記(R1 Ps)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質

[請求項6]
前記(s1)工程の3-ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記(D1 Tl)~(D3 Tl)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項1から5のいずれか一項に記載の分析方法。
(D1 Tl) 配列番号12のアミノ酸配列からなるタンパク質
(D2 Tl) 前記(D1 Tl)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
(D3 Tl) 前記(D1 Tl)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質

[請求項7]
前記(s1)工程の3-ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記(D1 Ab)~(D3 Ab)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項1から5のいずれか一項に記載の分析方法。
(D1 Ab) 配列番号11のアミノ酸配列からなるタンパク質
(D2 Ab) 前記(D1 Ab)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
(D3 Ab) 前記(D1 Ab)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質

[請求項8]
前記(s1)工程の3-ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記(D1 Cp)~(D3 Cp)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項1から5のいずれか一項に記載の分析方法。
(D1 Cp) 配列番号9のアミノ酸配列からなるタンパク質
(D2 Cp) 前記(D1 Cp)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
(D3 Cp) 前記(D1 Cp)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質

[請求項9]
前記(s1)工程の3-ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記(D1 Hs)~(D3 Hs)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項1から5のいずれか一項に記載の分析方法。
(D1 Hs) 配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質
(D2 Hs) 前記(D1 Hs)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
(D3 Hs) 前記(D1 Hs)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質

[請求項10]
下記(S1)~(S3)工程を含むことを特徴とする、被検試料中のコラーゲンの測定方法。
(S1)被検試料中のコラーゲンから、3-ヒドロキシプロリンを遊離させる遊離工程
(S2)前記(S1)工程で遊離した3-ヒドロキシプロリンの量を、請求項1から9のいずれか一項に記載の分析方法により測定する測定工程
(S3)予め求めた前記コラーゲンに対する3-ヒドロキシプロリンの割合係数に基づき、前記(S2)工程で測定した3-ヒドロキシプロリンの量からコラーゲンの量を算出する算出工程

[請求項11]
前記コラーゲンが、コラーゲンIVである、請求項10記載の測定方法。

[請求項12]
下記(R1 Tl)~(R3 Tl)からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする、新規タンパク質。
(R1 Tl) 配列番号14のアミノ酸配列からなるタンパク質
(R2 Tl) 前記(R1 Tl)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
(R3 Tl) 前記(R1 Tl)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質

[請求項13]
下記(R1 Ab)~(R3 Ab)からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする、新規タンパク質。
(R1 Ab) 配列番号1のアミノ酸配列からなるタンパク質
(R2 Ab) 前記(R1 Ab)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
(R3 Ab) 前記(R1 Ab)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質

[請求項14]
下記(R1 Cp)~(R3 Cp)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素。
(R1 Cp) 配列番号13のアミノ酸配列からなるタンパク質
(R2 Cp) 前記(R1 Cp)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
(R3 Cp) 前記(R1 Cp)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質

[請求項15]
下記(D1 Tl)~(D3 Tl)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素。
(D1 Tl) 配列番号12のアミノ酸配列からなるタンパク質
(D2 Tl) 前記(D1 Tl)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
(D3 Tl) 前記(D1 Tl)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質

[請求項16]
下記(D1 Ab)~(D3 Ab)からなる群から選択された少なくとも一つであることを特徴とする、新規タンパク質。
(D1 Ab) 配列番号11のアミノ酸配列からなるタンパク質
(D2 Ab) 前記(D1 Ab)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
(D3 Ab) 前記(D1 Ab)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質

[請求項17]
下記(D1 Cp)~(D3 Cp)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質であることを特徴とする、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素。
(D1 Cp) 配列番号9のアミノ酸配列からなるタンパク質
(D2 Cp) 前記(D1 Cp)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
(D3 Cp) 前記(D1 Cp)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質

[請求項18]
3-ヒドロキシプロリンの分析試薬であって、
3-ヒドロキシプロリン脱水酵素およびΔ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素を含むことを特徴とする、分析試薬。

[請求項19]
前記Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素が、請求項12記載のタンパク質である、請求項18記載の分析試薬。

[請求項20]
前記Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素が、請求項13記載のタンパク質である、請求項18記載の分析試薬。

[請求項21]
前記Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素が、請求項14記載のΔ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素である、請求項18記載の分析試薬。

[請求項22]
前記Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素が、下記(R1 Ps)~(R3 Ps)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項18記載の分析試薬。
(R1 Ps) 配列番号2のアミノ酸配列からなるタンパク質
(R2 Ps) 前記(R1 Ps)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質
(R3 Ps) 前記(R1 Ps)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質

[請求項23]
前記3-ヒドロキシプロリン脱水酵素が、請求項15記載の3-ヒドロキシプロリン脱水酵素である、請求項18から22のいずれか一項に記載の分析試薬。

[請求項24]
前記3-ヒドロキシプロリン脱水酵素が、請求項16記載のタンパク質である、請求項18から22のいずれか一項に記載の分析試薬。

[請求項25]
前記3-ヒドロキシプロリン脱水酵素が、請求項17記載の3-ヒドロキシプロリン脱水酵素である、請求項18から22のいずれか一項に記載の分析試薬。

[請求項26]
前記3-ヒドロキシプロリン脱水酵素が、下記(D1 Hs)~(D3 Hs)からなる群から選択された少なくとも一つのタンパク質である、請求項18から22のいずれか一項に記載の分析試薬。
(D1 Hs) 配列番号3のアミノ酸配列からなるタンパク質
(D2 Hs) 前記(D1 Hs)のアミノ酸配列において、1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入および/または付加されたアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質
(D3 Hs) 前記(D1 Hs)のアミノ酸配列に対して、80%以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質

[請求項27]
コラーゲンの測定試薬であって、
請求項18から26のいずれか一項に記載の3-ヒドロキシプロリンの分析試薬を含むことを特徴とする、測定試薬。

[請求項28]
下記(r1 Tl)~(r3 Tl)からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素遺伝子。
(r1 Tl)配列番号16の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(r2 Tl)前記(r1 Tl)の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(r3 Tl)前記(r1 Tl)の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

[請求項29]
下記(r1 Ab)~(r3 Ab)からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、新規遺伝子。
(r1 Ab)配列番号4の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(r2 Ab)前記(r1 Ab)の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(r3 Ab)前記(r1 Ab)の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

[請求項30]
下記(r1 Cp)~(r3 Cp)からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素遺伝子。
(r1 Cp)配列番号15の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(r2 Cp)前記(r1 Cp)の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(r3 Cp)前記(r1 Cp)の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、Δ 1-ピロリン-2-カルボン酸還元酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

[請求項31]
下記(d1 Tl)~(d3 Tl)からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子。
(d1 Tl)配列番号19の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(d2 Tl)前記(d1 Tl)の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d3 Tl)前記(d1 Tl)の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

[請求項32]
下記(d1 Ab)~(d3 Ab)からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、新規遺伝子。
(d1 Ab)配列番号17の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(d2 Ab)前記(d1 Ab)の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d3 Ab)前記(d1 Ab)の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

[請求項33]
下記(d1 Cp)~(d3 Cp)からなる群から選択された少なくとも一つのポリヌクレオチドからなることを特徴とする、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素遺伝子。
(d1 Cp)配列番号18の塩基配列からなるポリヌクレオチド
(d2 Cp)前記(d1 Cp)の塩基配列において、1もしくは数個の塩基が欠失、置換、挿入および/または付加された塩基配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
(d3 Cp)前記(d1 Cp)の塩基配列に対して、80%以上の同一性を有する塩基配列からなり、3-ヒドロキシプロリン脱水酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION EHIME UNIVERSITY
  • Inventor
  • WATANABE Seiya
  • TANIMOTO Yoshiaki
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LT LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN TD TG
Shikoku TLO is introducing the seeds of 4 inside 20 university and a technical college. Please ask to the following about the detailed contents of seeds. I am waiting for an inquiry.

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