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ALCOHOL PRODUCTION METHOD

外国特許コード	F150008570
整理番号	(S2014-0762-N0)
掲載日	2015年11月26日
出願国	世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）
国際出願番号	2015JP059854
国際公開番号	WO 2015147318
国際出願日	平成27年3月30日(2015.3.30)
国際公開日	平成27年10月1日(2015.10.1)
優先権データ	特願2014-068757 (2014.3.28) JP
発明の名称（英語）	ALCOHOL PRODUCTION METHOD
発明の概要（英語）	The present invention addresses the issue of providing a method that is more useful during the production of biofuel than conventional technology. Provided is an alcohol production method that is more useful than conventional technology, as a result of creating a cellulosome-expression plasmid, obtaining a microbe transformed by said plasmid, and culturing same.
出願人（英語） ※2012年7月以前掲載分については米国以外のすべての指定国	NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION MIE UNIVERSITY
発明者（英語）	MIYAKE HIDEO TAMARU YUTAKA
国際特許分類(IPC)	C12N 15/09 組換えＤＮＡ技術 C12N 1/19 外来遺伝物質の導入によって修飾されたもの C12N 1/21 外来遺伝物質の導入によって修飾されたもの C12P 7/08 副産物としてまたは廃棄物またはセルロース物質の基質からの製造 C12P 7/16 ブタノール C12R 1/145 クロストリジウム
指定国	National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN TD TG

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発明の名称	アルコールの製造方法
発明の概要	バイオ燃料の製造において、従来の技術に対してさらに有用な方法を提供することを課題とする。セルロソーム発現プラスミドを構築し、該プラスミドにより形質転換された微生物を得て、これを培養することにより、従来の技術に対してさらに有用なアルコールの製造方法を提供する。
特許請求の範囲	[請求項1] ｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域を含むセルロソーム発現プラスミド。 [請求項2] さらに、ｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を含む請求項１に記載のセルロソーム発現プラスミド。 [請求項3] 配列表配列番号２に示される塩基配列を含むｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域と、配列表配列番号３に示される塩基配列を含むｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を含む、請求項２に記載のセルロソーム発現プラスミド。 [請求項4] 請求項１～３のいずれかに記載のプラスミドを微生物に導入して得られる形質転換体。 [請求項5] 微生物がクロストリジウム属に属する微生物または酵母である請求項４に記載の形質転換体。 [請求項6] 微生物がクロストリジウム　ベイジェリンキまたはクロストリジウム　アセトブチリカムである請求項５に記載の形質転換体。 [請求項7] 請求項４～６のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程を含む、基質からアルコールを製造する方法。 [請求項8] 基質がセルロース系バイオマスである請求項７に記載のアルコールを製造する方法。 [請求項9] セルロース系バイオマスがローカストビーンガム、稲わら、バガス、コーンストーバー、スイッチグラス、ポプラまたは植物残渣である請求項８に記載のアルコールを製造する方法。
明細書	明　細　書発明の名称 : アルコールの製造方法技術分野 [0001] 本発明はセルロソーム発現プラスミド、該プラスミドにより形質転換された微生物、および該微生物によるアルコールの製造方法に関する。さらに詳しくは、セルロース系バイオマスを直接糖化可能なセルロソームを発現するためのプラスミドに関する。また、該プラスミドによって、アルコール発酵が可能な微生物の形質転換体を得て、ブタノール等のアルコールを製造する方法に関する。背景技術 [0002] 近年、稲わら、バッカス、植物残渣等のセルロース系バイオマスからエタノール、ブタノール等のアルコールをバイオ燃料として製造する様々な技術が開発されている。しかし、これらのバイオ燃料の製造はコストが高いという問題がある。そこで、次世代のバイオ燃料生産をはじめとしたバイオリファイナリーにおいて、「前処理、糖化、発酵」の工程を統合（Ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｅｄ　Ｂｉｏ－Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ：ＣＢＰ（以下、単にＣＢＰと示す場合がある））する技術開発が求められている。ＣＢＰによる技術革新により、さらにバイオ燃料製造のコストダウンが可能であり、最大で４１％のコストダウンが見込めるとされている（非特許文献１）。 [0003] この前処理、糖化に関して、稲わらなどのソフトバイオマスを直接分解できる微生物として、嫌気性中温菌であるクロストリジウム　セルロボランス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｃｅｌｌｕｌｏｖｏｒａｎｓ）が報告された（非特許文献２）。その後、クロストリジウム　セルロボランスは「セルロソーム」とよばれる超タンパク質複合体を生産することが確認された（非特許文献３）。 [0004] セルロソームは、セルロソーム骨格タンパク質にセルラーゼやヘミセルラーゼなどの酵素を搭載した超タンパク質複合体であり、基質に応じて酵素を組み合わせることでソフトバイオマスを効率よく分解する（非特許文献４）。本発明者らは、クロストリジウム　セルロボランスの全遺伝子情報を全ゲノム解析により解読し（非特許文献５）、この結果から、セルロソームの土台となるセルロソーム骨格タンパク質、セルロソーム骨格タンパク質と相互作用することができるセルラーゼ、ヘミセルラーゼなどの酵素やタンパク質、さらに分泌型の糖質関連酵素であるノンセルロソームの同定および分類を完了した。また、プロテオーム解析の結果から基質に応じたセルロソームやノンセルロソームに関する情報も得ている（非特許文献６～８）。 [0005] このうちクロストリジウム　セルロボランスが生産するセルロソーム骨格タンパク質の一つであるＣｂｐＡ（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ（以下、単にＣｂｐＡと示す場合がある））は、（１）結晶性セルロースと結合することができる糖質結合モジュール（ＣＢＭ）が１つ、（２）菌体の細胞表層と結合する表層ホモロジードメイン（ＳＬＨ）が４つ、（３）セルロソームを構成する酵素が持つドックリンドメインと結合するコヘシンドメインが９つあり、これらの（１）～（３）から構成される分子量が１８９，０００の比較的大きなタンパク質である。ｃｂｐＡ遺伝子の下流にはセルラーゼおよびヘミセルラーゼの遺伝子が多数存在し、ｃｂｐＡ遺伝子クラスターと呼ばれる遺伝子クラスターを形成している（非特許文献９）。 [0006] クロストリジウム属の微生物には、クロストリジウム　セルロボランスのようにセルロソームを形成してリグノセルロースを分解したり、ブタノールやエタノール等のアルコールやアセトンなどの有機溶媒を生産したりするものがいくつか知られている。例えば、クロストリジウム　アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）やクロストリジウム　ベイジェリンキ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）はブタノール生産菌として知られており、これらの微生物によるアセトン・ブタノール・エタノール（ＡＢＥ）発酵が、酵母を使ったエタノール発酵に続いて実用化されている（非特許文献１０）。ＡＢＥ発酵によるアセトン・ブタノール生産は、化学合成法により安価な合成アルコールが普及するにつれて衰退したが、化石燃料の高騰や地球温暖化等の問題から、近年、再び世界的に注目されている。 [0007] このようなバイオ燃料の製造のための技術として、例えば、特許文献１は、効率的にブタノールを得るために、クロストリジウム　アセトブチリカムやクロストリジウム　ベイジェリンキ等のクロストリジウム属に属する微生物を、一定量の乳酸を基質として含む環境（ｍｅｄｉｕｍ）で培養する方法を開示している。特許文献２は、酪酸の形成に関与するホスホトランスブチリラーゼをコードする遺伝子等の遺伝子が削除されているクロストリジウム属に属する微生物を培養することで、ｎ－ブタノールを高収率で生物学的に製造する方法を開示している。特許文献３は、アルコールの製造に直接関与するものではないが、セルロソ－ム足場タンパク質等の融合タンパク質をコードするポリ核酸を含む組換え微生物として、クロストリジウム属に属する微生物を得て、異種セルラーゼを分泌させる方法等を開示している。また、特許文献４は、クロストリジウム属に属する微生物等を培養することによって得られた１－ブタノール、２－ブタノール等の有機成分を特定のステップを経ることにより高濃度で回収する方法等を開示している。さらに、特許文献５は、クロストリジウム　セルロリティカム由来のセルロソーム構成タンパク質をコードする遺伝子（Ｃｅｌ５Ａ遺伝子またはＣｅｌ９Ｍ遺伝子）やピルビン酸脱炭酸酵素（ＰＤＣ）やアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ１）をコードする遺伝子等を組み込んだクロストリジウム　アセトブチリカムを得て、これを培養することにより、グルコースやセルロースを基質としてエタノールを産生させる方法等を開示している。この方法もセルロソーム発現プラスミドにより形質転換されたクロストリジウム属の微生物を用いて、アルコールを製造する方法に関するものであるが、セルロソームを構成しているタンパク質の種類や該タンパク質の由来、また生産させたセルロソームのサイズ等が本発明と異なり、生産しているアルコールも主にエタノールである。これらの技術により、バイオ燃料の製造において、微生物によるアルコール生産を効率化したり、回収率を高めたりすることが可能となりつつあるが、さらに有用な方法の提供が望まれている。先行技術文献特許文献 [0008] 特許文献1 : 特許第４６６５０６６号特許文献2 : 特表２０１０－５０８０１７号公報特許文献3 : 特表２０１１－５２９３３６号公報特許文献4 : 特表２０１３－５１３３９４号公報特許文献5 : 国際公開第２０１０／０６３７６６号パンフレット非特許文献 [0009] 非特許文献1 : Lynd, L. R., Laser, M. S., Bransby, D., Dale, B. E., Davison, B., Hamilton, R., Himmel, M., Keller, M., McMillan, J. D., Sheehan, J., and Wyman, C. E. (2008) How biotech can transform biofuels. Nat Biotechnol 26, 169-172 非特許文献2 : Sleat, R., Mah, R. A., and Robinson, R. (1984) Isolation and Characterization of an Anaerobic, Cellulolytic Bacterium, Clostridium cellulovorans sp. nov. Appl Environ Microbiol 48, 88-93 非特許文献3 : Shoseyov, O., Takagi, M., Goldstein, M. A., and Doi, R. H. (1992) Primary sequence analysis of Clostridium cellulovorans cellulose binding protein A. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 3483-3487 非特許文献4 : Lamed, R., Setter, E., and Bayer, E. A. (1983) Characterization of a cellulose-binding, cellulase-containing complex in Clostridium thermocellum. J Bacteriol 156, 828-836 非特許文献5 : Tamaru, Y., Miyake, H., Kuroda, K., Nakanishi, A., Kawade, Y., Yamamoto, K., Uemura, M., Fujita, Y., Doi, R. H., and Ueda, M. (2010) Genome sequence of the cellulosome-producing mesophilic organism Clostridium cellulovorans 743B. J Bacteriol 192, 901-902 非特許文献6 : Han, S. O., Yukawa, H., Inui, M., and Doi, R. H. (2005) Effect of carbon source on the cellulosomal subpopulations of Clostridium cellulovorans. Microbiology-Sgm., 151, 1491-1497 非特許文献7 : Morisaka, H., Matsui, K., Tatsukami, Y., Kuroda, K., Miyake, H., Tamaru, Y., Ueda, M. (2012) Profile of native cellulosomal proteins of Clostridium cellulovorans adapted to various carbon sources. AMB Express., 2, 37 非特許文献8 : Matsui, K., Bae, J., Esaka, K., Morisaka, H., Kuroda, K., Ueda, M. (2013) Exoproteome profiles of Clostridium cellulovorans grown on various carbon sources. Appl Environ Microbiol., 21, 6576-6584 非特許文献9 : Tamaru, Y., Karita, S., Ibrahim, A., Chan, H., and Doi, R. H. (2000) A large gene cluster for the Clostridium cellulovorans cellulosome. J Bacteriol 182, 5906-5910 非特許文献10 : Jones, D. T., and Woods, D. R. (1986) Acetone-butanol fermentation revisited. Microbiol Rev50, 484-524 発明の概要発明が解決しようとする課題 [0010] 本発明は、バイオ燃料の製造において、従来の技術に対してさらに有用な方法を提供することを課題とする。課題を解決するための手段 [0011] 本発明者は、上記課題の解決を目的として鋭意検討した結果、セルロソーム発現プラスミドを構築し、該プラスミドにより形質転換された微生物を得て、これを培養することにより、従来の技術に対してさらに有用なアルコールの製造方法が提供できることを見出し、本発明を完成するに至った。本発明によって構築されるプラスミドは、セルロース系バイオマスを直接糖化可能なセルロソームを発現するためのプラスミドであり、該プラスミドによって、アルコール発酵が可能な微生物の形質転換体を得ることにより、該微生物の培養におけるエタノール、ブタノール等のアルコールの生産効率を高めることが可能となる。 [0012] すなわち、本発明は、次の（１）～（９）に示されるアルコールの製造方法に関する。（１）ｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域を含むセルロソーム発現プラスミド。（２）さらに、ｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を含む上記（１）に記載のセルロソーム発現プラスミド。（３）配列表配列番号２に示される塩基配列を含むｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域と、配列表配列番号３に示される塩基配列を含むｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を含む、上記（２）に記載のセルロソーム発現プラスミド。（４）上記（１）～（３）のいずれかに記載のプラスミドを微生物に導入して得られる形質転換体。（５）微生物がクロストリジウム属に属する微生物または酵母である上記（４）に記載の形質転換体。（６）微生物がクロストリジウム　ベイジェリンキまたはクロストリジウム　アセトブチリカムである上記（５）に記載の形質転換体。（７）上記（４）～（６）のいずれかに記載の形質転換体を培養する工程を含む、基質からアルコールを製造する方法。（８）基質がセルロース系バイオマスである上記（７）に記載のアルコールを製造する方法。（９）セルロース系バイオマスがローカストビーンガム、稲わら、バガス、コーンストーバー、スイッチグラス、ポプラまたは植物残渣である上記（８）に記載のアルコールを製造する方法。発明の効果 [0013] 本発明によって構築されたセルローム発現プラスミドによりクロストリジウム　ベイジェリンキ等のアルコールを産生する微生物の形質転換体を得て、該形質転換体を培養することにより、セルロース系バイオマスから直接ブタノール等のアルコールを製造することが可能となる。これによりバイオ燃料の効率的な製造が可能となり、時間やコストを大幅に削減することができる。図面の簡単な説明 [0014] [図1] セルロソーム関連遺伝子およびノンセルロソーム関連遺伝子の遺伝子発現量を示した図である（実施例１）。 [図2] ｃｂｐＡ遺伝子の塩基配列におけるプロモーター領域およびシグナルペプチド領域を示した図である（実施例１）。 [図3] ｐＭＴＬ５００Ｅ－ｃｂｐＡ－ＭａｎＡのマップを示した図である（実施例１）。 [図4] 形質転換体において、導入した遺伝子の挿入の有無を確認した図である（実施例２）。 [図5] 形質転換体の酵素活性を確認した図である（実施例２）。 [図6] ローカストビーンガム（Ｌｏｃｕｓｔ　ｂｅａｎ　ｇｕｍ（以下、単にＬＢＧと示す場合がある））を含む培地における形質転換体の培養後の写真を示した図である（実施例３）。 [図7] ガスクロマトグラフィーによりブタノールの生産量を確認した図である（実施例３）。 [図8] ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体クロストリジウム　ベイジェリンキによるＬＢＧの分解結果を示した図である（実施例３）。発明を実施するための形態 [0015] 本発明の「セルロソーム発現プラスミド」は、微生物に導入することにより、該微生物にセルロソームを賦与し、セルロソーム発現能を与え得るプラスミドのことをいう。本発明の「セルロソーム発現プラスミド」は、セルロソームを構築し得る遺伝子を含んでいればよい。このような遺伝子として、セルロソーム骨格タンパク質をコードする遺伝子やセルロソーム骨格タンパク質と相互作用するセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の酵素をコードする遺伝子等のセルロソーム関連遺伝子が挙げられる。これらのセルロソーム関連遺伝子は従来知られるいずれの遺伝子であってもよい。 [0016] 本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含まれる遺伝子として、例えば、セルロソーム骨格タンパク質をコードするｃｂｐＡ遺伝子やｈｂｐＡ遺伝子が挙げられる。このｃｂｐＡ遺伝子として、配列表配列番号１に示される塩基配列が挙げられるが、ｃｂｐＡ遺伝子と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号１に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。 [0017] また、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」は、ｃｂｐＡ遺伝子として示される塩基配列を全て含む必要はなく、少なくとも配列表配列番号２に示されるｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域を含むものであれば良い。また、ｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号２に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。 [0018] さらに、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」は、ｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域に加えて配列表配列番号３に示されるｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を含むものであることが好ましい。また、ｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドと同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号３に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。また、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」は、ｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域やｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域に加えて、配列表配列番号４に示されるｃｂｐＡ遺伝子のコーディング領域を含むものであることがさらに好ましい。ｃｂｐＡ遺伝子のコーディング領域と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号４に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。 [0019] セルロソーム骨格タンパク質をコードするｈｂｐＡ遺伝子としては、配列表配列番号８に示される塩基配列が挙げられる。また、ｈｂｐＡ遺伝子と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号８に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。 [0020] さらに、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含まれる遺伝子として、例えば、セルロソーム骨格タンパク質と相互作用するセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の酵素をコードするｅｘｇＳ遺伝子、ｅｎｇＨ遺伝子、ｅｎｇＫ遺伝子、ｅｎｇＬ遺伝子またはｅｎｇＭ遺伝子等が挙げられる。また、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」は、マンナナーゼ等のその他の酵素をコードするｍａｎＡ遺伝子やｍａｎＢ遺伝子等を含んでいても良い。このｅｘｇＳ遺伝子として、配列表配列番号５に示される塩基配列が挙げられる。また、ｅｘｇＳ遺伝子と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号５に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。ｅｎｇＨ遺伝子としては、配列表配列番号６に示される塩基配列が挙げられる。また、ｅｎｇＨ遺伝子と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号６に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。 [0021] さらに、ｅｎｇＫ遺伝子として、配列表配列番号７に示される塩基配列が挙げられる。また、ｅｎｇＫ遺伝子と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号７に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。ｅｎｇＬ遺伝子として、配列表配列番号９に示される塩基配列が挙げられる。また、ｅｎｇＬ遺伝子と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号９に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。 [0022] その他の酵素として、例えばマンナナーゼをコードする遺伝子としてｍａｎＡ遺伝子が挙げられる。ｍａｎＡ遺伝子としては、配列表配列番号１０に示される塩基配列が挙げられる。また、ｍａｎＡ遺伝子と同様に作用し得るのであれば、配列表配列番号１０に示される塩基配列に８５％以上の同一性を有する塩基配列、９０％以上の同一性を有する塩基配列や９５％以上の同一性を有する塩基配列で示されるものも、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」に含むことができる。 [0023] 本発明の「セルロソーム発現プラスミド」は、セルロソームの構築が可能であれば、これらのセルロソーム骨格タンパク質をコードする遺伝子、セルロソーム骨格タンパク質と相互作用するセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の酵素をコードする遺伝子や、その他の酵素をコードする遺伝子を２つ以上複数組み合わせて含むことができる。本発明の「セルロソーム発現プラスミド」は、セルロソームを微生物に発現させるためのベクターに、ｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域、またはｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域とｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域を組み込むことにより構築することができる。これらにｃｂｐＡ遺伝子のコーディング領域を組み合わせても良く、さらにセルロソーム骨格タンパク質をコードする遺伝子、セルロソーム骨格タンパク質と相互作用するセルラーゼ、ヘミセルラーゼ等の酵素をコードする遺伝子や、その他の酵素をコードする遺伝子を組み合わせて組み込んでも良い。 [0024] 本発明の「セルロソーム発現プラスミド」において使用するベクターは、従来知られるいずれのものであっても良いが、例えば、ブタノール生産菌のホスト－ベクター系として知られるＥ．ｃｏｌｉ－Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍのシャトルベクター（参考文献１、２）、ｐＭＴＬ５００Ｅベクター（参考文献３）や、ｐＭＴＬ８００００ベクター（参考文献４）等を使用することができる。参考文献１：Tummala, S. B., Welker, N. E., and Papoutsakis, E. T. (1999) Development and characterization of a gene expression reporter system for Clostridium acetobutylicum ATCC 824. Appl Environ Microbiol 65, 3793-3799 参考文献２：Collas, F., Kuit, W., Clement, B., Marchal, R., Lopez-Contreras, A. M., and Monot, F. (2012) Simultaneous production of isopropanol, butanol, ethanol and 2,3-butanediol by Clostridium acetobutylicum ATCC 824 engineered strains. AMB Express 2, 45 参考文献３：Oultram, J. D., Loughlin, M., Swinfield, T-J., Brehm, J. K., Thompson, D. E., Minton, N. P. (1988) Introduction of plasmids into whole cells of Clostridium acetobutylicum by electroporation. FEMS Microbiol. Letters 56: 83-88 [0025] このようにして構築した「セルロソーム発現プラスミド」として、例えば、ｐＭＴＬ５００ＥベクターにｃｂｐＡ遺伝子のプロモーター領域、ｃｂｐＡ遺伝子のシグナルペプチドをコードする領域およびｃｂｐＡ遺伝子のコーディング領域を組み合わせ、さらにｈｂｐＡ遺伝子、ｅｘｇＳ遺伝子、ｅｎｇＨ遺伝子、ｅｎｇＫ遺伝子、ｅｎｇＬ遺伝子およびｍａｎＡ遺伝子を組み合わせて組み込んだｐＭＴＬ５００Ｅ－ｃｂｐＡ－ＭａｎＡ等が挙げられる。なお、これらの遺伝子等のベクターへの組み込み方法は、従来知られているいずれの方法であっても良い。 [0026] 本発明の「形質転換体」は、本発明の「セルロソーム発現プラスミド」を微生物に導入することで、セルロソームを賦与された微生物のことをいう。本発明においてセルロソームを賦与する微生物は、従来知られているいずれの微生物であっても良いが、エタノール、ブタノール等のアルコールを生産し得る、バイオマス燃料の製造に有用な微生物であることが好ましい。このような微生物として、バイオマス燃料の製造に有用なクロストリジウム属に属する微生物等が挙げられ、クロストリジウム属に属する微生物としてクロストリジウム　ベイジェリンキ、クロストリジウム　アセトブチリカム等が挙げられる。また、酵母を「形質転換体」としても良い。 [0027] 本発明の「アルコールを製造する方法」は、本発明の「形質転換体」を基質を含む培地で培養する工程を含むことにより、基質からエタノールおよび／またはブタノールを製造する方法のことをいう。このような基質として、セルロース系バイオマスを挙げることができる。本発明のセルロース系バイオマスとして、ローカストビーンガム、稲わら、バッカス、コーンストーバー、スイッチグラス、ポプラまたは植物残渣等が挙げられる。 [0028] 以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明がこれらに限定されないことは言うまでもない。 [0029] ［実施例１］プラスミドの構築１．ＲＮＡ－Ｓｅｑ解析によるプロモーターの検討１）グルコース、セロビオース、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、キシラン、ローカストビーンガム（ＬＢＧ）、ペクチンの６種類の糖を炭素源とした培地（非特許文献２、参照）でクロストリジウム　セルロボランスをそれぞれ培養し、対数増殖期中期にｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。その後、ｍＲＮＡ－Ｓｅｑライブラリーの調製とｒＲＮＡの量を減少させるためにＤＳＮ処理によるＮｏｍａｌｉｚａｔｉｏｎを行った後、次世代シークエンサーであるＨｉＳｅｑ　２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に供した。シークエンスから得られたリード配列をゲノム配列にマッピングし、各遺伝子の発現量を、遺伝子の長さとリード量で正規化した単位（ＲＰＫＭ）で算出することにより求めた（参考文献５）。参考文献５：Mortazavi, A,. Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B.(2008) Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods., 5, 621-628 [0030] ２）クロストリジウム　セルロボランスにおいて発現した遺伝子のうち、セルロソーム関連遺伝子およびノンセルロソーム関連遺伝子に着目し、上記１）において求めた各遺伝子におけるＲＰＫＭに対して底を２とした対数変換を行い、得られた値［ｌｏｇ２（ＲＰＫＭ）］を遺伝子発現量とした。得られたセルロソーム関連遺伝子およびノンセルロソーム関連遺伝子の遺伝子発現量をヒートマップにより図１に表した。図１の（Ａ）は全てのセルロソーム関連遺伝子およびノンセルロソーム関連遺伝子の発現量を示したものである。このうち遺伝子発現量［ｌｏｇ２（ＲＰＫＭ）］が３．５以上のセルロソーム関連遺伝子を（Ｂ）にまとめて示し、同様のノンセルロソーム関連遺伝子を（Ｃ）にまとめて示した。これらの（Ａ）～（Ｃ）において、発現量が高い遺伝子は赤色、低い遺伝子は緑色、中間の遺伝子は黒色で示している。 [0031] ３）上記１）および２）の結果、セルロソーム関連遺伝子では、ｃｂｐＡ遺伝子クラスターに含まれる遺伝子（ｃｂｐＡ、ｅｘｇＳ、ｅｎｇＨ、ｅｎｇＫ、ｈｂｐＡ、ｅｎｇＬ、ｍａｎＡ、ｅｎｇＭ）とｍａｎＧＨ２６Ａ（ｍａｎＡ）、ｍａｎＧＨ２６Ｂ（ｍａｎＢ）がいずれの炭素源においても遺伝子発現量［ｌｏｇ２（ＲＰＫＭ）］が３．５以上の高い発現量を示すことが確認できた。従って、この結果より、クロストリジウム　ベイジェリンキにセルロソームを賦与する本発明のプラスミドの構築にあたり、ｃｂｐＡ遺伝子クラスターの上流に位置するｃｂｐＡ遺伝子のプロモーターを選択した。また、菌体の表層に発現させるか、もしくは分泌させるために、そのシグナルペプチドも使用した。 [0032] 配列表配列番号１に、このｃｂｐＡ遺伝子の塩基配列を示すとともに、図２において、このｃｂｐＡ遺伝子の塩基配列におけるプロモーター領域（図２：太字、一重下線部（配列表配列番号２））、シグナルペプチド領域（図２：イタリック体、二重下線部（配列表配列番号３））をそれぞれ示した。また、配列表配列番号４にｃｂｐＡ遺伝子のコーディング領域の塩基配列を示し、配列表配列番号５にｅｘｇＳ遺伝子の塩基配列、同配列番号６にｅｎｇＨ遺伝子の塩基配列、同配列番号７にｅｎｇＫ遺伝子の塩基配列、同配列番号８にｈｂｐＡ遺伝子の塩基配列、同配列番号９にｅｎｇＬ遺伝子の塩基配列、同配列番号１０にｍａｎＡ遺伝子の塩基配列をそれぞれ示した。ｅｘｇＳ、ｅｎｇＨ、ｅｎｇＫ、ｅｎｇＬはセルラーゼ遺伝子であり、ｈｂｐＡはセルロソーム骨格タンパク質遺伝子であり、ｍａｎＡはマンナナーゼ遺伝子である（非特許文献９、参照）。 [0033] ２．セルロソーム発現用プラスミドの構築１）上記１．の結果より、ｃｂｐＡ遺伝子クラスターのｃｂｐＡ遺伝子からｍａｎＡ遺伝子までの遺伝子によりセルロソームの構築を行った。ｃｂｐＡ遺伝子からｍａｎＡ遺伝子までの領域（配列表配列番号１１）は、表１に示したプライマーによるＰＣＲによって増幅し、これをｐＭＴＬ５００Ｅベクターに挿入した。ｃｂｐＡ遺伝子からｍａｎＡ遺伝子までの領域を表１に示したプライマー（配列表配列番号１２、１３）により、クロストリジウム　セルロボランスのゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行い増幅した。表１の各プライマーは、増幅した断片をプラスミドに挿入するために、プラスミドと相同配列となるような塩基配列（表１、下線部）を含むものであった。 [0034] [表1] [0035] ２）上記１）によって増幅したｃｂｐＡ遺伝子からｍａｎＡ遺伝子の断片を精製し、線状化したｐＭＴＬ５００Ｅベクターに、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオ）によってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）反応を行い、セルロソーム発現用プラスミドとした。このセルロソーム発現用プラスミドを大腸菌ＨＳＴ０８株へ導入した後、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天培地に植菌し３７℃で一晩静置培養した。コロニーＰＣＲにより、ｃｂｐＡ遺伝子からｍａｎＡ遺伝子が挿入されているコロニーを選択してＬＢ液体培地で培養した後、プラスミドＤＮＡを抽出した。このようにして得られたセルロソーム発現用プラスミドは、以下、本発明においてｐＭＴＬ５００Ｅ－ｃｂｐＡ－ＭａｎＡと示す。図３にｐＭＴＬ５００Ｅ－ｃｂｐＡ－ＭａｎＡのマップを示した。 [0036] なお、図３における各部分はそれぞれ次のものを示す。ＡｐＲ、ｅｍＲ：抗生物質耐性遺伝子斜線部：プロモーター領域ｃｂｐＡ、ｈｂｐＡ：セルロソーム骨格タンパク質遺伝子ｅｘｇＳ、ｅｎｇＨ、ｅｎｇＫ、ｅｎｇＬ：セルラーゼ遺伝子ｍａｎＡ：マンナナーゼ遺伝子 [0037] ［実施例２］１．形質転換体の作製１）エレクトロポレーション法により、ｐＭＴＬ５００Ｅ－ＣｂｐＡ－ＭａｎＡを導入し、クロストリジウム　ベイジェリンキの形質転換を行った。クロストリジウム　ベイジェリンキ（ＮＢＲＣ　１０３９０９）（（独）製品評価技術基盤機構より分譲を受けた）をＯＤ６００＝０．３になるまで表２の組成で作製した培地で培養した。この培養液を５ｍＬ容のチューブに入れ、嫌気チャンバー中の卓上遠心機で室温、２，４００ｇ、５分間遠心分離して集菌した。この上清を取り除き、氷上で冷したエレクトロポレーション緩衝液（２７０ｍＭ　スクロース、１０ｍＭ　ＭｇＣｌ_２、０．６ｍＭ　ＮａＨ_２ＰＯ_４、４．４ｍＭ　ＮａＨ_２ＰＯ_４　ｐＨ６．０）を１ｍＬ加えて菌体を懸濁し、再び５分間遠心分離して集菌した。この上清を取り除き、１０ｍＭが含まれていない冷えたエレクトロポレーション緩衝液（２７０ｍＭ　スクロース、０．６ｍＭ　ＮａＨ_２ＰＯ_４、４．４ｍＭ　ＮａＨ_２ＰＯ_４　ｐＨ６．０）を０．４ｍＬ加えて再懸濁し、氷上で１０分間静置した。滅菌済みの１．５ｍＬ容チューブに２０μＬの菌体懸濁液と２５ｎｇのｐＭＴＬ５００Ｅ－ＣｂｐＡ－ＭａｎＡを加えて混合し、氷上で８分間静置した。この混合液を、氷上で冷した０．１ｃｍギャップ滅菌済みエレクトロポレーションキュベット（ＢＩＯ－ＲＡＤ）に移し、Ｇｅｎｅ　Ｐｕｌｓｅｒ　Ｘｃｅｌｌ（商標）エレクトロポレーションシステム（ＢＩＯ－ＲＡＤ）により、エレクトロポレーション法による形質転換を行った。エレクトロポレーションの条件は、７００Ｖ、２００Ω、２５μＦで行った。エレクトロポレーションを行った後、キュベットを氷上で１０分間静置した。その後、１７０μＬの表２の組成で作製した培地を加え、混合してから２ｍＬ容の密栓できるチューブに移し、３７℃で２．５時間静置培養した。ここまでの操作は全て嫌気チャンバー内で行った。 [0038] ２）上記１）のサンプルの入ったチューブを嫌気チャンバーから取り出し、表２の組成からなる培地に１．５％　Ａｇａｒを含んだ７ｍＬの培地を滅菌して溶解し、培地に二酸化炭素を吹き込みながら植菌した。植菌の際に、エリスロマイシンを４０μｇ／ｍＬになるように加えた。酸素が入らないようにブチル栓をし、ロールチューブ作製器（三紳工業株式会社）でロールチューブを作製した。作製したロールチューブを３７℃で一晩培養した。形質転換後、コロニーＰＣＲにより導入した遺伝子が挿入されているかを確認した。コロニーを鋳型とし、表１に記載のプライマーによりＰＣＲ反応を行い、導入した遺伝子の挿入を確認した（図４）。このようにして得られた形質転換体（ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体クロストリジウム　ベイジェリンキ）は、以下、単にＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体と示す場合がある。 [0039] なお、図４における各部分はそれぞれ次のものを示す。Ｍ：１ｋｂ　Ｅｘｔｅｎｄ　ＤＮＡ　Ｌａｄｄｅｒ（Ｂｉｏ　Ｌａｂｓ）１：ｐＭＴＬ５００Ｅ－ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ２：ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体のコロニー鋳型ＰＣＲ３：野生型のクロストリジウム　ベイジェリンキのコロニー鋳型ＰＣＲ [0040] [表2] [0041] ２．酵素活性の評価ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体クロストリジウム　ベイジェリンキの酵素活性を、コンゴーレッドによる活性染色によって評価した。ＬＢＧは不溶性であるため、ＬＢＧと同じマンナンを構成糖として持ち可溶性であるグルコマンナンを炭素源として、表３に示した組成で培地を作製した。滅菌後、ゲル化する前に嫌気チャンバー内でエリスロマイシンを２０μｇ／ｍＬになるように加え、シャーレに分注した。作製したシャーレにＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体とコントロールとして空ベクターを形質転換したｐＭＴＬ５００Ｅ形質転換体の培養液を白金耳で植菌し、３７℃で２日間静置培養した。ここまでの操作はすべて嫌気チャンバー内で行った。培養後、シャーレに１％コンゴーレッド溶液を１ｍＬ加えスプレッターで広げ、５分間染色した。その後、１Ｍ　ＮａＣｌ水溶液を３ｍＬ加え脱色を４回繰り返して行った。その結果、図５に示すように、ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体を植菌したもの（図５：Ｂ）はコロニーの周りにハローが観察されたが、ｐＭＴＬ５００Ｅ形質転換体を植菌したもの（図５：Ａ）には観察されなかった。従って、この結果より、ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体がグルコマンナンの分解活性を有することが確認できた。 [0042] [表3] [0043] ［実施例３］アルコールの製造ＬＢＧを含む培地でＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体クロストリジウム　ベイジェリンキを培養し、反応生成物を検出した。即ち、ＬＢＧを炭素源として含む培地を表４の組成で１００ｍＬ容の密栓できるバイアル瓶に４０ｍＬずつ作製した。嫌気チャンバー内で培地にエリスロマイシンが１０μｇ／ｍＬになるように加え、その後、ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体と空ベクターを形質転換したｐＭＴＬ５００Ｅ形質転換体の植菌を行った。また、エリスロマイシンを含まない培地も作製し、それには野生型のクロストリジウム　ベンジェリンキも植菌した。それらは全て３７℃で３日間静置培養した。 [0044] その結果、図６に示したように、野生型のクロストリジウム　ベイジェリンキ（図６：Ａ）や、空ベクターを形質転換したｐＭＴＬ５００Ｅ形質転換体（図６：Ｂ）を培養した系では、培養後も培地が濁ったままであり、培地に含まれるＬＢＧをほとんど分解されなかった。一方、ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体（図６：Ｃ）を培養した系では、培養後の培地が透過しており、培地に含まれるＬＢＧがほぼすべて分解されたことが確認できた。そして、ガスクロマトグラフィーによりブタノール生産量を調べたところ、空ベクターを形質転換したｐＭＴＬ５００Ｅ形質転換体を培養した系（図７：Ａ）ではブタノールの生産が確認できなかったが、ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体を培養した系（図７：Ｂ）では、９．３ｍｇ／ｍＬのブタノールを生産していることが確認できた。 [0045] [表4] [0046] さらに、ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体クロストリジウム　ベイジェリンキの培養後の培地（培養上清）と野生型のクロストリジウム　ベイジェリンキの培養後の培地（培養上清）をサンプルとし、基質として０．５％のＬＢＧを含む培地で３７℃で１日間反応させた。その反応溶液に展開溶媒（１－ブタノール：酢酸：水＝２：１：１）を加えてＴＬＣに供与し、分解産物を確認した。 [0047] 図８にＴＬＣの結果を示した。図８の１は各糖をスポットしたマーカーであり、上からマンノース、マンノビオース、マンノトリオース、マンノテトラオース、マンノペンタオース、マンノヘキサオースのスポットを示す。また、図８の４は基質であるＬＢＧのスポットを示す。図８の２は、ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ形質転換体の培地（培養上清）をサンプルとし、基質と反応させた結果を示したものであり、マンノヘキサオース（６糖）に相当する位置に分解産物が確認され、基質であるＬＢＧのスポットの色が薄くなっていた。従って、この結果より、ＣｂｐＡ－ＭａｎＡ転換体によって、ＬＢＧを分解できることが確認できた。図８の３は、野生型のクロストリジウム　ベイジェリンキの培養上清をサンプルとし、基質と反応させた結果を示したものであるが、ＬＢＧの分解産物は確認されず、基質であるＬＢＧのスポットの減少も確認されなかった。 [0048] 実施例１～実施例３において、セルロソーム発現プラスミドを構築し、これを導入した形質転換体を得て、セルロース系バイオマスであるローカストビーンガムからブタノールを製造することが可能となった。一般に、セルロース系バイオマスからのバイオ燃料を得るには、前処理→糖化→発酵→蒸留の各工程が必要になる。しかし、本発明によって、クロストリジウム　セルロボランスのセルロソームが賦与されたクロストリジウム　ベイジェリンキにより、セルロース系バイオマスであるローカストビーンガムを直接糖化し、発酵することが可能となる。これにより、セルロース系バイオマスからのブタノールの製造を１つのタンクで行うことが可能となり、従来、バイオ燃料製造に要していた時間とコストを大幅に削減することができる。産業上の利用可能性 [0049] 本発明によって構築されたセルローム発現プラスミドは、アルコールを産生する微生物の形質転換体を得るために、広く流通させることができる。このプラスミドを導入することによって得られた形質転換体は、培養によってセルロース系バイオマスから直接アルコール等を製造できるため、効率的なバイオ燃料の製造が可能となる。