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METHOD FOR INDUCING DIFFERENTIATION OF INSULIN-PRODUCING CELLS

Foreign code F160008677
File No. (S2014-0990-N0)
Posted date Feb 5, 2016
Country WIPO
International application number 2015JP064380
International publication number WO 2015178397
Date of international filing May 19, 2015
Date of international publication Nov 26, 2015
Priority data
  • P2014-104019 (May 20, 2014) JP
Title METHOD FOR INDUCING DIFFERENTIATION OF INSULIN-PRODUCING CELLS
Abstract The purpose of the present invention is to provide a method for inducing the differentiation of insulin-producing cells efficiently in a xeno-free culture system. Provided are (1) a step for culturing stem cells in a medium including an activator of activin receptor-like kinase-4,7 and GSK inhibitor, then in a medium containing an activator of activin receptor-like kinase-4,7; (2) a step for culturing the cells obtained in step (1) in a medium containing hedgehog signaling inhibitor and FGF; (3) a step for culturing the cells obtained in step (2) in a medium containing a retinoic acid receptor agonist, hedgehog signaling inhibitor, and BMP signaling inhibitor; (4) a step for culturing the cells obtained in step (3) in a medium containing TGF-βI-type activin receptor-like kinase-4,5,7 inhibitor and BMP signaling inhibitor; and (5) a step for culturing the cells obtained in step (4) in a medium containing a phosphodiesterase inhibitor.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
幹細胞を、以下の工程(1)~(5)で培養することを特徴とする、インスリン産生細胞の分化誘導方法:
(1)幹細胞を、(1-1)アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤およびGSK3阻害剤を含む培地で培養し、次いで、(1-2)アクチビン受容体様キナーゼ-4,7の活性化剤を含む培地で培養する工程、
(2)前記工程(1)で得られた細胞を、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤およびFGFを含む培地で培養する工程、
(3)前記工程(2)で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、およびBMPシグナル伝達阻害剤を含む培地で培養する工程、
(4)前記工程(3)で得られた細胞を、TGF-βI型アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7阻害剤、およびBMPシグナル伝達阻害剤を含む培地で培養する工程、
(5)前記工程(4)で得られた細胞を、ホスホジエステラーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程。
[請求項2]
前記工程(1-2)の培地が、実質的にGSK3阻害剤を含まない培地である、請求項1に記載の分化誘導方法。
[請求項3]
前記工程(3)および(4)におけるBMPシグナル伝達阻害剤がNOGGINであり、工程(5)のホスホジエステラーゼ阻害剤がIBMXである、請求項1または2に記載の分化誘導方法。
[請求項4]
工程(3)および工程(4)におけるNOGGINの濃度が、少なくとも100ng/mL以上である、請求項3に記載の分化誘導方法。
[請求項5]
工程(3)および工程(4)におけるNOGGINの濃度が、少なくとも200~500ng/mLである、請求項4に記載の分化誘導方法。
[請求項6]
工程(3)が、さらにTGF-βI型アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7阻害剤を含み、工程(4)が、さらにプロテインキナーゼC活性化因子を含み、工程(5)が、さらにGLP-1受容体アゴニスト、ニコチンアミド、およびアデニル酸シクラーゼ活性化因子を含む、請求項1~5のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[請求項7]
工程(3)におけるレチノイン酸アゴニストがレチノイン酸であり、工程(2)および(3)におけるヘッジホッグシグナル伝達阻害剤がKAAD-シクロパミンである、請求項1~6のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[請求項8]
工程(3)におけるTGF-βI型アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7阻害剤がSB431542であり、工程(5)におけるGLP-1受容体アゴニストがエキセンジン-4である、請求項6または7に記載の分化誘導方法。
[請求項9]
上記工程(1)~(5)の全てを、ゼノフリー培養系で行うことを特徴とする、請求項1~8のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[請求項10]
幹細胞由来の内胚葉細胞を、以下の工程(a)~(d)で培養することを特徴とする、インスリン産生細胞の分化誘導方法:
(a)内胚葉細胞を、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤およびFGFを含む培地で培養する工程、
(b)前記工程(a)で得られた細胞を、レチノイン酸受容体アゴニスト、ヘッジホッグシグナル伝達阻害剤、およびBMPシグナル伝達阻害剤を含む培地で培養する工程、
(c)前記工程(b)で得られた細胞を、TGF-βI型アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7阻害剤、およびBMPシグナル伝達阻害剤を含む培地で培養する工程、
(d)前記工程(c)で得られた細胞を、ホスホジエステラーゼ阻害剤を含む培地で培養する工程。
[請求項11]
前記工程(b)および(c)におけるBMPシグナル伝達阻害剤がNOGGINであり、工程(d)のホスホジエステラーゼ阻害剤がIBMXである、請求項10に記載の分化誘導方法。
[請求項12]
工程(b)および工程(c)におけるNOGGINの濃度が、少なくとも100ng/mL以上である、請求項11に記載の分化誘導方法。
[請求項13]
工程(c)および工程(d)におけるNOGGINの濃度が、200~500ng/mLである、請求項12に記載の分化誘導方法。
[請求項14]
工程(b)が、さらにTGF-βI型アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7阻害剤を含み、工程(c)が、さらにプロテインキナーゼC活性化因子を含み、工程(d)が、さらにGLP-1受容体アゴニスト、ニコチンアミド、およびアデニル酸シクラーゼ活性化因子を含む、請求項10~13のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[請求項15]
工程(b)におけるレチノイン酸アゴニストがレチノイン酸であり、工程(a)および(b)におけるヘッジホッグシグナル伝達阻害剤がKAAD-シクロパミンである、請求項10~14のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[請求項16]
工程(b)におけるTGF-βI型アクチビン受容体様キナーゼ-4,5,7阻害剤がSB431542であり、工程(d)におけるGLP-1受容体アゴニストがエキセンジン-4である、請求項14または15に記載の分化誘導方法。
[請求項17]
上記工程(a)~(d)の全てを、ゼノフリー培養系で行うことを特徴とする、請求項10~16のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[請求項18]
幹細胞が、人工多能性幹細胞(iPS細胞)、胚性幹細胞(ES細胞)またはヒトの体性幹細胞である請求項1~17のいずれか一つに記載の分化誘導方法。
[請求項19]
請求項1~18のいずれか一つに記載の方法で得られたインスリン産生細胞。
[請求項20]
請求項19の細胞を含む医薬組成物。
[請求項21]
請求項1~18のいずれか一つに記載の方法で得られたインスリン産生細胞を用いることを特徴とする糖尿病治療薬のスクリーニング方法。
[請求項22]
インスリン産生細胞を被験物質とともに培養する工程を含む、請求項21に記載のスクリーニング方法。
[請求項23]
さらに細胞によるインスリン分泌を検出する工程を含む、請求項22に記載のスクリーニング方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION KUMAMOTO UNIVERSITY
  • Inventor
  • KUME SHOEN
  • SHIRAKI NOBUAKI
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN TD TG
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