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METHOD FOR PRODUCING FIBROUS PROTEIN MATERIAL AND CELL CULTURING METHOD

Foreign code F160008702
File No. (S2014-1300-N0)
Posted date Mar 30, 2016
Country WIPO
International application number 2015JP071799
International publication number WO 2016021498
Date of international filing Jul 31, 2015
Date of international publication Feb 11, 2016
Priority data
  • P2014-158604 (Aug 4, 2014) JP
Title METHOD FOR PRODUCING FIBROUS PROTEIN MATERIAL AND CELL CULTURING METHOD
Abstract Provided is a technique for obtaining a fibrous protein material in which cells are embedded at a high density, and with which it is possible to: make an extracellular matrix component contact the cells discretionarily; control the three-dimensional form; maintain the shape of a tissue after hydrogel removal; efficiently proliferate cells in a tissue; form intercellular interaction; and uniformly inseminate cells into a tissue. This method for producing a fibrous protein material comprises: continuously introducing a first aqueous solution in which sodium alginate and a protein have been dissolved and a gelling agent aqueous solution to a flow path structure that includes an inlet to which the first aqueous solution is introduced, an inlet to which the gelling agent aqueous solution is introduced, inlet flow paths connected to the respective inlets, a merging flow path where the inlet flow paths merge, and an outlet downstream of the merging flow path; forming a hydrogel by continuously gelling the first aqueous solution inside the flow path structure; and chemically crosslinking the protein included in the hydrogel outside or inside the flow path structure, and removing alginic acid included in the hydrogel.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
アルギン酸ナトリウムおよびタンパク質が溶解された第一の水溶液を導入するための少なくとも一つの入口A1~Am(m≧1)と、
ゲル化剤水溶液を導入するための少なくとも一つの入口G1~Gn(n≧1)と、
入口A1~Amおよび入口G1~Gnにそれぞれ接続される入口流路CA1~CAmおよびCG1~CGnと、
入口流路CA1~CAmおよび入口流路CG1~CGnが同時あるいは段階的に合流する合流流路Mと、
合流流路Mの下流に存在する出口O
を有する流路構造Xに対し、
前記第一の水溶液および前記ゲル化剤水溶液をそれぞれ流路構造Xに連続的に導入し、
流路構造Xの内部において、前記第一の水溶液を連続的にゲル化してハイドロゲルを形成し、
その後、流路構造Xの外部あるいは内部において、前記ハイドロゲルに含まれる前記タンパク質を化学的に架橋し、さらに前記ハイドロゲルに含まれるアルギン酸を除去する
繊維状タンパク質材料の作製方法。
[請求項2]
アルギン酸ナトリウムおよびタンパク質が溶解された第一の水溶液、および、アルギン酸ナトリウムが溶解された第二の水溶液を、それぞれ導入するための少なくとも二つの入口A1~Am(m≧2)と、
ゲル化剤水溶液を導入するための少なくとも一つの入口G1~Gn(n≧1)と、
入口A1~Amおよび入口G1~Gnにそれぞれ接続される入口流路CA1~CAmおよびCG1~CGnと、
少なくとも1つの合流点P1~Po(o≧1)において入口流路CA1~CAmが同時あるいは段階的に合流し、合流点P1~Poの下流における少なくとも一つの合流点Q1~Qp(p≧1)において入口流路CG1~CGnが同時あるいは段階的に合流する合流流路Mと、
合流流路Mの下流に存在する出口O
を有する流路構造Xに対し、
前記第一の水溶液、前記第二の水溶液、および前記ゲル化剤水溶液をそれぞれ流路構造Xに連続的に導入し、
流路構造Xの内部において、前記第一の水溶液および前記第二の水溶液を接触させ、流路構造Xの内部において前記第一の水溶液および前記第二の水溶液を連続的にゲル化してハイドロゲルを形成し、
その後、流路構造Xの外部あるいは内部において、前記ハイドロゲルに含まれる前記タンパク質を化学的に架橋し、さらに前記ハイドロゲルに含まれるアルギン酸を除去する
繊維状タンパク質材料の作製方法。
[請求項3]
流路構造Xは、バッファー水溶液を導入するための少なくとも一つの入口B1~Bq(q≧1)と、
入口B1~Bqにそれぞれ接続し、同時あるいは段階的に合流流路Mに合流する入口流路CB1~CBqを有しており、
入口B1~Bqから連続的に前記バッファー水溶液を導入する
請求項1乃至2のいずれか1項に記載の繊維状タンパク質材料の作製方法。
[請求項4]
入口流路CB1~CBqは、合流点P1~Poと合流点Q1~Qpの間に存在する少なくとも一つの合流点R1~Rr(r≧1)において合流流路Mに合流する
請求項1乃至3のいずれか1項に記載の繊維状タンパク質材料の作製方法。
[請求項5]
流路構造Xは、少なくとも部分的に、微細加工を施した平板状のポリマー基板と、平面状の他のポリマー基板を貼り合せることによって形成されている
請求項1乃至4のいずれか1項に記載の繊維状タンパク質材料の作製方法。
[請求項6]
流路構造Xは、その幅・深さ・直径等の値のうち少なくともいずれか一つが、少なくとも部分的に300マイクロメートル以下である
請求項1乃至5のいずれか1項に記載の繊維状タンパク質材料の作製方法。
[請求項7]
前記第一の水溶液および前記第二の水溶液に含まれるアルギン酸ナトリウムの濃度は、それぞれの水溶液100mLあたり0.5g以上3g以下である
請求項1乃至6のいずれか1項に記載の繊維状タンパク質材料の作製方法。
[請求項8]
前記タンパク質とは、ゼラチン、コラーゲン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、の少なくともいずれかを含む
請求項1乃至7のいずれか1項に記載の繊維状タンパク質材料の作製方法。
[請求項9]
前記第一の水溶液に含まれる前記タンパク質の濃度は、100mLあたり0.1g以上10g以下である
請求項1乃至8のいずれか1項に記載の繊維状タンパク質材料の作製方法。
[請求項10]
前記ハイドロゲルは繊維状であり、また、前記ハイドロゲルの直径は少なくとも部分的に50マイクロメートル以下である
請求項1乃至9のいずれか1項に記載の繊維状タンパク質材料の作製方法。
[請求項11]
前記ゲル化剤水溶液および/あるいは前記バッファー水溶液は、増粘剤を含む
請求項1乃至10のいずれか1項に記載の繊維状タンパク質材料の作製方法。
[請求項12]
前記増粘剤とは、デキストラン、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、アルギン酸プロピレングリコール、あるいはそれらの任意の組み合わせである
請求項1乃至11のいずれか1項に記載の繊維状タンパク質材料の作製方法。
[請求項13]
前記ゲル化剤水溶液は、塩化カルシウム、塩化ストロンチウム、塩化バリウム、塩化マグネシウム、塩化鉄(III)の少なくともいずれかを含む
請求項1乃至12のいずれか1項に記載の繊維状タンパク質材料の作製方法。
[請求項14]
前記第一の水溶液、前記第二の水溶液、前記ゲル化剤水溶液、および前記バッファー水溶液のうち、最小の粘度を有するものと最大の粘度を有するものの粘度の比率が、室温において、1:1~1:10の範囲にある
請求項1乃至13のいずれか1項に記載の繊維状タンパク質材料の作製方法。
[請求項15]
グルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、パラホルムアルデヒド、タンニン酸、ゲニピン、N-ヒドロキシコハク酸イミドを有するタンパク質架橋剤、トランスグルタミナーゼ、のうち少なくともいずれかを用いることによって前記ハイドロゲルに含まれるタンパク質を架橋する
請求項1乃至14のいずれか1項に記載の繊維状タンパク質材料の作製方法。
[請求項16]
アルギン酸リアーゼ、クエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸のうち少なくともいずれかを用いることによって前記ハイドロゲルに含まれるアルギン酸を除去する
請求項1乃至15のいずれか1項に記載の繊維状タンパク質材料の作製方法。
[請求項17]
請求項1乃至16のいずれか1項に記載の繊維状タンパク質材料の作製方法を用いて得られた繊維状タンパク質材料に対し、細胞を付着させることを特徴とする
細胞培養方法。
[請求項18]
請求項1乃至16のいずれか1項に記載の繊維状タンパク質材料を細胞とともに細胞培養用ハイドロゲル前駆体水溶液に懸濁させ、
前記細胞培養用ハイドロゲル前駆体水溶液をゲル化させることで形成した細胞培養用ハイドロゲル内部において細胞を培養する
請求項17に記載の細胞培養方法。
[請求項19]
前記細胞培養用ハイドロゲルは、
アルギン酸、架橋ポリエチレングリコール、アガロース、コラーゲン、架橋ゼラチン、フィブリン、のうち少なくともいずれか一つを主成分とした細胞培養用ハイドロゲルである
請求項18に記載の細胞培養方法。
[請求項20]
前記細胞培養用ハイドロゲル前駆体水溶液に懸濁させた前記繊維状タンパク質材料の体積密度は、体積割合で10%以上である
請求項18乃至19のいずれか1項に記載の細胞培養方法。
[請求項21]
前記細胞培養用ハイドロゲルに包埋された細胞の濃度は、1mL当たり100万個以上である
請求項18乃至20のいずれか1項に記載の細胞培養方法。
[請求項22]
細胞とは、哺乳動物由来の接着性細胞である
請求項17乃至21のいずれか1項に記載の細胞培養方法。
[請求項23]
前記細胞培養用ハイドロゲルにおいて前記細胞を一定期間培養した後に、前記細胞培養用ハイドロゲルを除去し、さらに前記細胞を培養する
請求項17乃至22のいずれか1項に記載の細胞培養方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION CHIBA UNIVERSITY
  • Inventor
  • YAMADA MASUMI
  • SEKI MINORU
  • HORI AYAKA
  • HIRAI YU
  • YAJIMA YUYA
  • KITAGAWA YOICHI
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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