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CALCIUM REPORTER GENE

Foreign code F160008719
File No. (AF25P001)
Posted date Apr 14, 2016
Country WIPO
International application number 2015JP002869
International publication number WO 2015190083
Date of international filing Jun 8, 2015
Date of international publication Dec 17, 2015
Priority data
  • P2014-120828 (Jun 11, 2014) JP
Title CALCIUM REPORTER GENE
Abstract A calcium reporter protein that exhibits superior fluorescence properties and calcium reactivity is obtained by providing DNA in which one nucleotide among the nucleotide coding the calmodulin-binding sequence (ckkap sequence) of the calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase and the nucleotide coding the calcium-binding sequence (CaM sequence) of calmodulin is bonded to the 5' terminal side of a nucleotide coding a fluorescent protein, and the other nucleotide thereamong is bonded to the 3' terminal side of the nucleotide coding a fluorescent protein. The calcium reporter protein coded by this DNA exhibits superior fluorescence properties and calcium reactivity in comparison to existing calcium reporter proteins due to having the ckkap sequence as a binding domain for CaM sequences to which calcium has bonded.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Calcium, muscle contraction, hormone secretion and neuronal excitability, such as a change of enzyme activity as modulators of the function of various cells, plays an essential role in maintaining and adjusting the biological function of the responsible for. In vivo (extra cellular and intracellular) to measure the concentration of calcium, conventional, referred to as a calcium sensor protein (calcium indicator) is used.
In recent years, the nature of the higher functions in the brain of a living cell and the intra-cellular domain level cognitive activity for analysis, the change in calcium concentration accompanying neural activity at a very high speed imaging and technique are required, a superior in calcium reactivity has been desired the development of fluorescent calcium sensor.
As calcium functioning as a sensor protein, fluorescent protein and a partial sequence of calmodulin to a partial sequence of the myosin light chain kinase bound to known calcium indicator protein. This calcium indicator proteins, calcium binding protein calmodulin to a partial sequence of the three-dimensional structure is altered, the fluorescence of the fluorescent protein (GFP or RFP) that utilizes the change in intensity. For example, the non-patent document 1, using the calcium indicator protein as a fluorescent protein mApple (R-GECO1) is described. In addition, the patent document 1, to improve the created R-GECO1, large fluorescent than R-GECO1 R-CaMP1.01 and showing the intensity change, to improve the created R-CaMP1.01, fluorescence intensity larger than R-CaMP1.01 change, intracellular localization of the improved R-CaMP1.07 is disclosed.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列(ckkap配列)をコードするヌクレオチド及びカルモジュリンのカルシウム結合配列(CaM配列)をコードするヌクレオチドの一方のヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの5’末端側に、他方のヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの3’末端側に結合されているDNA。
[請求項2]
ckkap配列をコードするヌクレオチドの塩基配列が、配列番号1~3に示される塩基配列のいずれか一つである、請求項1記載のDNA。
[請求項3]
ckkap配列をコードするヌクレオチドと蛍光タンパクをコードするヌクレオチド、及び、蛍光タンパクをコードするヌクレオチドとCaM配列をコードするヌクレオチドが、アミノ酸リンカーをコードするヌクレオチドを介してそれぞれ結合されている、請求項1又は2記載のDNA。
[請求項4]
蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの5’末端にckkap配列をコードするヌクレオチドが、3’末端側にCaM配列をコードするヌクレオチドが結合されており、
ckkap配列をコードするヌクレオチドと蛍光タンパクをコードするヌクレオチドがアミノ酸リンカーAをコードするヌクレオチドを介して結合されており、かつ、
蛍光タンパクをコードするヌクレオチドとCaM配列をコードするヌクレオチドがアミノ酸リンカーBをコードするヌクレオチドを介して結合されており、
アミノ酸リンカーA及びアミノ酸リンカーBの組み合わせが以下のいずれか一つである、請求項3記載のDNA。
アミノ酸リンカーA(-Pro-Val-)・アミノ酸リンカーB(-Thr-Arg)、
アミノ酸リンカーA(-Leu-Asp-)・アミノ酸リンカーB(-Thr-Asp-)、
アミノ酸リンカーA(-Met-Asp-)・アミノ酸リンカーB(-Thr-Asp-)、
アミノ酸リンカーA(-Leu-Glu-)・アミノ酸リンカーB(-Thr-Asp-)、
アミノ酸リンカーA(-Arg-Asp-)・アミノ酸リンカーB(-Thr-Lys-)、
アミノ酸リンカーA(-Arg-Asp-)・アミノ酸リンカーB(-Phe-Pro-)、
アミノ酸リンカーA(-Phe-Asp-)・アミノ酸リンカーB(-Ala-Asp-)、
アミノ酸リンカーA(-Phe-Asp-)・アミノ酸リンカーB(-Thr-Asp-)、
アミノ酸リンカーA(-Gln-Asp-)・アミノ酸リンカーB(-Thr-Asp-)、及び
アミノ酸リンカーA(-Phe-Asp-)・アミノ酸リンカーB(-Phe-Asp-)。
[請求項5]
請求項1~4のいずれか一項に記載のDNAを含むベクター。
[請求項6]
カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列(ckkap配列)をコードするヌクレオチド及びカルモジュリンのカルシウム結合配列(CaM配列)をコードするヌクレオチドの一方のヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの5’末端側に、他方のヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの3’末端側に結合されているカルシウム指示遺伝子が導入された形質転換細胞。
[請求項7]
カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列(ckkap配列)をコードするヌクレオチド及びカルモジュリンのカルシウム結合配列(CaM配列)をコードするヌクレオチドの一方のヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの5’末端側に、他方のヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの3’末端側に結合されているカルシウム指示遺伝子が導入された、ヒトを除くトランスジェニック動物。
[請求項8]
カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列(ckkap配列)及びカルモジュリンのカルシウム結合配列(CaM配列)の一方が蛍光タンパクのN末端側に、他方が前記蛍光タンパクのC末端側に結合されているタンパク。
[請求項9]
ckkap配列が、配列番号4~6,15~19に示されるアミノ酸配列のいずれか一つである、請求項8記載のタンパク。
[請求項10]
ckkap配列と蛍光タンパク、及び、蛍光タンパクとCaM配列が、アミノ酸リンカーを介してそれぞれ結合されている、請求項8又は9記載のタンパク。
[請求項11]
蛍光タンパクのN末端にckkap配列が、C末端側にCaM配列が結合されており、
ckkap配列と蛍光タンパクがアミノ酸リンカーAを介して結合されており、かつ、
蛍光タンパクとCaM配列がアミノ酸リンカーBを介して結合されており、
アミノ酸リンカーA及びアミノ酸リンカーBの組み合わせが以下のいずれか一つである、請求項10記載のタンパク。
アミノ酸リンカーA(-Pro-Val-)・アミノ酸リンカーB(-Thr-Arg)、
アミノ酸リンカーA(-Leu-Asp-)・アミノ酸リンカーB(-Thr-Asp-)、
アミノ酸リンカーA(-Met-Asp-)・アミノ酸リンカーB(-Thr-Asp-)、
アミノ酸リンカーA(-Leu-Glu-)・アミノ酸リンカーB(-Thr-Asp-)、
アミノ酸リンカーA(-Arg-Asp-)・アミノ酸リンカーB(-Thr-Lys-)、
アミノ酸リンカーA(-Arg-Asp-)・アミノ酸リンカーB(-Phe-Pro-)、
アミノ酸リンカーA(-Phe-Asp-)・アミノ酸リンカーB(-Ala-Asp-)、
アミノ酸リンカーA(-Phe-Asp-)・アミノ酸リンカーB(-Thr-Asp-)、
アミノ酸リンカーA(-Gln-Asp-)・アミノ酸リンカーB(-Thr-Asp-)、及び
アミノ酸リンカーA(-Phe-Asp-)・アミノ酸リンカーB(-Phe-Asp-)。
[請求項12]
細胞内で発現されたカルシウム指示タンパクから放射される蛍光を検出する手順を含む、細胞の活動電位の測定方法であって、
前記カルシウム指示タンパクは、カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列(ckkap配列)及びカルモジュリンのカルシウム結合配列(CaM配列)の一方が蛍光タンパクのN末端側に、他方が前記蛍光タンパクのC末端側に結合されている、カルシウム指示タンパクであることを特徴とする方法。
[請求項13]
細胞内で発現されたカルシウム指示タンパクから放射される蛍光を検出する手順を含む、細胞内カルシウムイオンのイメージング方法であって、
前記カルシウム指示タンパクは、カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列(ckkap配列)及びカルモジュリンのカルシウム結合配列(CaM配列)の一方が蛍光タンパクのN末端側に、他方が前記蛍光タンパクのC末端側に結合されている、カルシウム指示タンパクであることを特徴とする方法。
[請求項14]
カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列(ckkap配列)をコードするヌクレオチド及びカルモジュリンのカルシウム結合配列(CaM配列)をコードするヌクレオチドの一方のヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの5’末端側に、他方のヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの3’末端側に結合されている、カルシウム指示遺伝子を前記細胞に導入する手順を含む、請求項12記載の細胞活動電位の測定方法又は請求項13記載の細胞内カルシウムイオンのイメージング方法。
[請求項15]
細胞の活動電位の測定及び/又は細胞内カルシウムイオンのイメージングのためのカルシウム指示試薬であって、
カルシウムカルモジュリン依存性タンパク質キナーゼキナーゼのカルモジュリン結合配列(ckkap配列)をコードするヌクレオチド及びカルモジュリンのカルシウム結合配列(CaM配列)をコードするヌクレオチドの一方のヌクレオチドが蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの5’末端側に、他方のヌクレオチドが前記蛍光タンパクをコードするヌクレオチドの3’末端側に結合されているDNA又は該DNAを含むベクターを含む、試薬。
[請求項16]
前記細胞が神経細胞である、請求項15記載の試薬。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY
  • Inventor
  • BITO, Haruhiko
  • INOUE, Masatoshi
  • TAKEUCHI, Atsuya
  • NAKAI, Junichi
  • OHKURA, Masamichi
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
Reference ( R and D project ) CREST Elucidation of the Principles of Formation and Function of the Brain Neural Network and Creation of Control Technologies AREA
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