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METHOD FOR INDUCING DIFFERENTIATION INTO GERMLINE USING CONCENTRATED UNDIFFERENTIATED GERM CELLS HAVING ENGRAFTMENT ABILITY

Foreign code F160008752
File No. (S2014-0738-N0)
Posted date Jun 2, 2016
Country WIPO
International application number 2015JP001690
International publication number WO 2016042684
Date of international filing Mar 25, 2015
Date of international publication Mar 24, 2016
Priority data
  • P2014-187702 (Sep 16, 2014) JP
Title METHOD FOR INDUCING DIFFERENTIATION INTO GERMLINE USING CONCENTRATED UNDIFFERENTIATED GERM CELLS HAVING ENGRAFTMENT ABILITY
Abstract The present invention addresses the problem of providing a method for inducing the differentiation of separated germ cells into a germline, said method being suitable for practical use, by, in a surrogate parent fish farming method, improving the engraftment ability of transplanted germ cells to a host gonad and increasing the transplantation efficiency. To solve the problem, provided is a method for inducing the differentiation of separated germ cells into a germline by intraperitoneally transplanting separated fish-derived germ cells having been separated from fish testicle or ovary into a host fish individual before or after hatching, said method comprising: preliminarily acquiring an antibody capable of specifically recognizing an undifferentiated germ cell having an engraftment ability to a host gonad; using the antibody, separating and concentrating spermatogonia having an engraftment ability to a host gonad from the separated fish-derived germ cells to be used in the intraperitoneal transplantation into the host fish; and intraperitoneally transplanting the separated germ cells into the host fish before or after hatching to thereby improve the engraftment ability of the germ cells to the host fish gonad and induce the differentiation of the separated germ cells into the germline.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
魚類の精巣又は卵巣から分離された、魚類由来の分離生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類の腹腔内への移植により宿主魚類個体に移植することからなる分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法において、予め、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞の細胞表面抗原に対する抗体であって、該未分化生殖細胞を特異的に認識する抗体を取得し、該抗体を用いて、宿主魚類の腹腔内への移植に用いる魚類由来の分離生殖細胞から、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞を分離、濃縮し、該分離、濃縮した分離生殖細胞を孵化前後の宿主魚類の腹腔内へ移植することにより、生殖細胞の宿主魚類生殖腺への生着能を向上させたことを特徴とする分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[請求項2]
宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞が、未分化精巣から分離された未分化精原細胞であるA型精原細胞、成熟を開始した精巣或いは成熟精巣から分離されたA型精原細胞、或いは、卵巣から分離された卵原細胞であることを特徴とする請求項1に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[請求項3]
魚類の精巣又は卵巣から分離される、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞の細胞表面抗原に対する抗体であって、該未分化生殖細胞を特異的に認識する抗体の取得が、(1)vasa-GFP蛍光を指標に単離した、単離直後の生きた未分化生殖細胞を抗原とし、該抗原を免疫源とする抗体産生ハイブリドーマを作製し、(2)該ハイブリドーマが産生する抗体について、該抗体が生殖細胞を認識する抗体であることを検出するために、生殖細胞特異的にGFPを発現するvasa-GFP遺伝子導入魚を用いて、該抗体のvasa-GFP陽性生殖細胞への標識能を、該GFPを指標に検出し、(3)該生殖細胞を認識する抗体が、未分化生殖細胞を認識するものであることを検出するために、未分化生殖細胞特異的にGFPを発現するvasa-GFP遺伝子導入魚の未分化精巣或いは卵巣を用いて、該未分化生殖細胞への抗体による標識能を検出することにより、行われることを特徴とする請求項1又は2に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[請求項4]
魚類の精巣又は卵巣から分離される、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞の細胞表面抗原に対する抗体であって、該未分化生殖細胞を特異的に認識する抗体が、未分化精巣におけるA型精原細胞、成熟を開始した精巣或いは成熟精巣におけるA型精原細胞、或いは、卵巣における卵原細胞からなる未分化生殖細胞を特異的に認識する抗体であることを特徴とする請求項3に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[請求項5]
請求項3において取得した宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞の細胞表面抗原に対する抗体であって、該未分化生殖細胞を特異的に認識する抗体において、分化生殖細胞を含む、成熟を開始した精巣或いは成熟精巣において、未分化生殖細胞であるA型精原細胞を特異的に認識する抗体を検出し、取得するために、生殖細胞特異的にGFPを発現するvasa-GFP遺伝子を導入した魚類の精巣生殖細胞を用いて、GFP強陽性の未分化精原細胞が特異的に標識されている抗体を検出、取得することを特徴とする請求項3又は4に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[請求項6]
未分化精巣、或いは分化生殖細胞を含む、成熟を開始した精巣或いは成熟精巣において、未分化生殖細胞であるA型精原細胞を特異的に認識する抗体が、抗体産生ハイブリドーマNo.80(NITE AP-01936:BP-01936)又はハイブリドーマNo.95(NITE AP-01937:BP-01937)が産生するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項5に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[請求項7]
請求項3において取得した宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞の細胞表面抗原に対する抗体であって、該未分化生殖細胞を特異的に認識する抗体において、卵巣において、未分化生殖細胞である卵原細胞を特異的に認識する抗体を検出し、取得するために、生殖細胞特異的にGFPを発現するvasa-GFP遺伝子を導入した魚類の卵巣細胞中に含まれるわずかなGFP陽性の生殖細胞を特異的に標識する抗体を検出、取得することを特徴とする請求項3又は4に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[請求項8]
卵巣において、未分化生殖細胞である卵原細胞を特異的に認識する抗体が、抗体産生ハイブリドーマNo.172(NITE AP-01938:BP-01938)又はハイブリドーマNo.189(NITE AP-01939:BP-01939)が産生するモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項7に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[請求項9]
vasa-GFP蛍光を指標に単離した、単離直後の生きた生殖細胞を抗原とし、該抗原を免疫源とする抗体産生ハイブリドーマの作製が、単離直後の生きた精原細胞をマウスに免疫し、回収したリンパ節由来の細胞と、ミエローマ細胞とを融合させたハイブリドーマの作製からなることを特徴とする請求項3に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[請求項10]
ハイブリドーマが産生する抗体について、該抗体が生殖細胞を認識する抗体であることを検出するために、生殖細胞特異的にGFPを発現するvasa-GFP遺伝子導入魚を用いて、該抗体のvasa-GFP陽性の生殖細胞への標識能を検出する方法が、GFPを指標に、単離した生殖細胞のハイブリドーマが産生する抗体による標識能を化学発色法による検出によって行ものであることを特徴とする請求項3に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[請求項11]
ハイブリドーマが産生する抗体について、生殖細胞を認識する抗体が、未分化生殖細胞を認識するものであることを検出するために、生殖細胞特異的にGFPを発現するvasa-GFP遺伝子導入魚の未分化精巣或いは卵巣を用いて、該未分化生殖細胞への抗体による標識能を検出する方法が、GFP陽性の未分化生殖細胞の抗体による標識を、蛍光免疫染色により検出するものであることを特徴とする請求項3に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[請求項12]
ハイブリドーマが産生する抗体について、該未分化生殖細胞を認識する抗体が、分化生殖細胞を含む成熟を開始した精巣或いは成熟精巣において、未分化生殖細胞であるA型精原細胞を特異的に認識する抗体を検出する方法が、生殖細胞特異的にGFPを発現するvasa-GFP遺伝子を導入した魚類の精巣生殖細胞を用いて、GFP強陽性の未分化精原細胞が特異的に標識されている抗体による特異的標識能の検出を、蛍光免疫染色及びフローサイトメーターにより行うものであることを特徴とする請求項6に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[請求項13]
ハイブリドーマが産生する未分化生殖細胞を特異的に認識する抗体において、卵巣において、未分化生殖細胞である卵原細胞を特異的に認識する抗体の検出を、生殖細胞特異的にGFPを発現するvasa-GFP遺伝子を導入した魚類の卵巣細胞中に含まれるわずかなGFP陽性の生殖細胞を特異的に標識する抗体を、蛍光免疫染色により検出するものであることを特徴とする請求項7に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[請求項14]
魚類の精巣又は卵巣から分離された、魚類由来の分離生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類の腹腔内への移植により宿主魚類個体に移植することからなる分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法において、未分化生殖細胞を特異的に認識する抗体を取得し、該抗体を用いて、宿主魚類の腹腔内への移植に用いる魚類由来の分離生殖細胞から、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞の分離、濃縮を、未分化生殖細胞を特異的に認識する抗体を用いた磁気細胞単離法を用いた生着能を有する未分化生殖細胞の分離、濃縮により行うことを特徴とする請求項1に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[請求項15]
魚類由来の分離生殖細胞が、宿主魚類とは異系統又は異種の魚類由来の生殖細胞であることを特徴とする請求項1~14のいずれかに記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[請求項16]
宿主魚類が、サケ科魚類、ニベ、及びサバ科から選択され、異種の魚類がマグロであることを特徴とする請求項15に記載の分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法。
[請求項17]
請求項5に記載の方法により作製され、分化生殖細胞を含む、成熟を開始した精巣或いは成熟精巣において、未分化生殖細胞である未分化A型精原細胞を特異的に認識する抗体である、抗体産生ハイブリドーマNo.80(NITE AP-01936:BP-01936)又はハイブリドーマNo.95(NITE AP-01937:BP-01937)が産生するモノクローナル抗体。
[請求項18]
請求項7に記載の方法により作製され、卵巣において、未分化生殖細胞である卵原細胞を特異的に認識する抗体である、抗体産生ハイブリドーマNo.172(NITE AP-01938:BP-01938)又はハイブリドーマNo.189(NITE AP-01939:BP-01939)が産生するモノクローナル抗体。
[請求項19]
魚類の精巣又は卵巣から分離された、魚類由来の分離生殖細胞を、孵化前後の宿主魚類の腹腔内への移植により宿主魚類個体に移植することからなる分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法において、用いる分離生殖細胞を、予め、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞の細胞表面抗原に対する抗体であって、該未分化生殖細胞を特異的に認識する抗体を取得し、該抗体を用いて、宿主魚類の腹腔内への移植に用いる魚類由来の分離生殖細胞から、宿主生殖腺への生着能を有する未分化生殖細胞を分離、濃縮することからなる、生着能を向上させた分離生殖細胞の生殖細胞系列への分化誘導方法に用いる分離生殖細胞の分離、濃縮方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION TOKYO UNIVERSITY OF MARINE SCIENCE AND TECHNOLOGY
  • Inventor
  • HAYASHI MAKOTO
  • SADAIE SAKIKO
  • YOSHIZAKI GORO
  • YAZAWA RYOSUKE
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG

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