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COLLAGEN FUSION PROTEIN AND DRUG SCREENING METHOD USING SAME meetings

Foreign code F160008899
File No. (S2015-0733-N0)
Posted date Nov 11, 2016
Country WIPO
International application number 2016JP059066
International publication number WO 2016152882
Date of international filing Mar 22, 2016
Date of international publication Sep 29, 2016
Priority data
  • P2015-057688 (Mar 20, 2015) JP
Title COLLAGEN FUSION PROTEIN AND DRUG SCREENING METHOD USING SAME meetings
Abstract The purpose of the present invention is to construct a system whereby secretion of procollagen from an animal cells can be detected. This purpose can be achieved by a fusion protein of a fluorescent protein or luminescent protein and a collagen-related protein which is a collagen protein, a procollagen protein, a preprocollagen protein having a repeating amino acid sequence of Gly-Xaa-Yaa (where Gly represents glycine and Xaa and Yaa represent arbitrary amino acids), or a variant or fragment thereof.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Collagen, protein 30% occupies in the living body, and cell adhesion skeletal support important proteins and have functions such as, for example, human body bone, cartilage, ligament, tendon, cornea, skin, liver, muscle tissue such as the major constituents. Is collagen, fibrous collagen collagen to form fibrils, in a non - fibrillar collagen does not form fibrils present. Fibrous collagen, the polypeptide chains of the collagen triple helical structure is present 3 3 (tropocollagen) gather to form. 3 Is the double helix structure of the topo collagen, by self-assemble, shifted by 1/4 molecular length alignment, (fibrillar collagen) collagen fibrils to form. Further, this collagen fibrils, and merge the many, collagen fibers (collagen fiber bundles) to form. Further, in the corneal stroma and cortical bone, collagen fibers aligned in the same direction to form a two-dimensional layers, each layer 1 this layer is further laminated veneer-like and then a three-dimensional layer that takes the plate structure. This veneer-like three-dimensional layer board structure is collagen, are transparent and have a high strength.
Of such a collagen molecular abnormalities caused by collagen diseases (for example, dermatomyositis, polymyositis) or corneal cloudiness and the like, a method of treatment has not been established in many cases. This is, collagen secretion of an as-yet and the higher-order structure formation processes in the course also, one cause of 1. And the higher-order structure of collagen secretion analysis step of forming the course can be performed if, due to the collagen molecular abnormalities of clarification of the cause of the disease, and in the development of therapeutic thereof also can be used as an effective means.
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲
[請求項1]
 Gly-Xaa-Yaa(式中、Glyはグリシンであり、そしてXaa及びYaaは任意のアミノ酸である)の繰り返しアミノ酸配列を有するプレプロコラーゲンタンパク質、プロコラーゲンタンパク質、コラーゲンタンパク質、若しくはそれらの変異体、又はそれらの断片である、コラーゲン関連タンパク質と、蛍光タンパク質又は発光タンパク質との融合タンパク質。
[請求項2]
 前記蛍光タンパク質又は発光タンパク質が、プロコラーゲンタンパク質のN末端のN-プロプロテイン、コラーゲンタンパク質、又はC末端のC-プロプロテインに結合又は挿入されている、請求項1に記載の融合タンパク質。
[請求項3]
 前記蛍光タンパク質又は発光タンパク質がコラーゲンタンパク質のC末端から30アミノ酸よりN末端側に挿入されており、及び/又は蛍光タンパク質又は発光タンパク質がC-プロプロテインのN末端から30アミノ酸よりC末側に挿入されている、請求項1又は2に記載の融合タンパク質。
[請求項4]
 請求項1~3のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現したコラーゲン関連疾患細胞と、試験物質とを接触させる工程、及び
融合タンパク質の動態を解析する工程、
を含むコラーゲン関連疾患の治療又は予防物質のスクリーニング方法。
[請求項5]
 Gly-Xaa-Yaa(式中、Glyはグリシンであり、そしてXaa及びYaaは任意のアミノ酸である)の繰り返しアミノ酸配列を有するプレプロコラーゲンタンパク質、プロコラーゲンタンパク質、コラーゲンタンパク質、若しくはそれらの変異体、又はそれらの断片である、コラーゲン関連タンパク質、又は前記コラーゲン関連タンパク質と蛍光タンパク質又は発光タンパク質との融合タンパク質をコードする核酸。
[請求項6]
 請求項5に記載の核酸を含むベクター。
[請求項7]
 請求項6に記載のベクターを含む、ベクター含有宿主細胞。
[請求項8]
 前記宿主細胞が、mcrA、Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)、φ80lacZΔM15、ΔlacX74、deoR、recA1、endA1、araD139、Δ(ara, leu)7697、galU、galK、rpsL(str r)、nupG、galE、hsdS、及びそれらの2つ以上の組み合わせからなる群から選択される遺伝子変異を有する大腸菌である、請求項7に記載のベクター含有宿主細胞。
[請求項9]
 前記大腸菌が、DH10B、TOP10F’、MC1061、XL1-Blue MRF’、AG1、BL21(DE3)、DB3.1、DH1、DH5α、DH5α Turbo、DH12S、DM1、E.Cloni(r)5alpha、E.Cloni(r)10G、E.Cloni(r)10GF’、ER2267、HB101、HMS174(DE3)、High-Control(tm) BL21(DE3)、High-Control(tm)10G、IJ1126、JM108、JM109、Mach1、MC1061、MFDpir、OmniMAX2、OverExpress(tm)C41(DE3)、OverExpress(tm)C43(DE3)、Rosetta(DE3)、SOLR、SS320、STBL2、STBL3、STBL4、SURE、SURE2、TG1、TOP10、XL2-Blue、XL2-BlueMRF’、及びXL10-Goldからなる群から選択される、請求項8に記載のベクター含有宿主細胞。
[請求項10]
 請求項8又は9に記載のベクター含有宿主細胞から得られるベクター。
[請求項11]
 請求項6に記載のベクターをmcrA、Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)、φ80lacZΔM15、ΔlacX74、deoR、recA1、endA1、araD139、Δ(ara, leu)7697、galU、galK、rpsL(str r)、nupG、galE、hsdS、及びそれらの2つ以上の組み合わせからなる群から選択される遺伝子変異を有する大腸菌に導入することを特徴とする、ベクター含有大腸菌の製造方法。
[請求項12]
 請求項6に記載のベクターをmcrA、Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC)、φ80lacZΔM15、ΔlacX74、deoR、recA1、endA1、araD139、Δ(ara, leu)7697、galU、galK、rpsL(str r)、nupG、galE、hsdS、及びそれらの2つ以上の組み合わせからなる群から選択される遺伝子変異を有する大腸菌に導入する工程、及び前記ベクターを回収する工程を含むことを特徴とする、ベクターの製造方法。
[請求項13]
(1)請求項6に記載のベクターを、動物細胞に導入する工程、及び
(2)前記ベクターが導入された動物細胞からコラーゲンを分泌させる工程、
を含む、コラーゲンの製造方法。
[請求項14]
(1)請求項6に記載のベクターを、動物細胞に導入する工程、及び
(2)前記ベクターが導入された動物細胞において蛍光又は発光を検出する工程、
を含む、コラーゲンの蛍光又は発光検出方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • TOKYO INSTITUTE OF TECHNOLOGY
  • Inventor
  • TANAKA Toshiaki
  • IKOMA Toshiyuki
  • TANAKA Junzo
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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