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METHOD FOR SITE-SPECIFIC INSERTION OF FOREIGN DNA INTO ANIMAL CELL GENOME AND CELL OBTAINED USING SAME

Foreign code F170009072
File No. (S2015-1830-N0)
Posted date May 29, 2017
Country WIPO
International application number 2016JP059174
International publication number WO 2017029833
Date of international filing Mar 23, 2016
Date of international publication Feb 23, 2017
Priority data
  • P2015-162612 (Aug 20, 2015) JP
  • 201562265425 (Dec 10, 2015) US
Title METHOD FOR SITE-SPECIFIC INSERTION OF FOREIGN DNA INTO ANIMAL CELL GENOME AND CELL OBTAINED USING SAME
Abstract Provided is a method for site-specific insertion of a foreign DNA into an animal cell genome, said method comprising: (1) a step for constructing a donor plasmid in which 100-300 bp DNAs having a sequence homologous to an insertion site on a genome are ligated to the upstream and downstream of a 0.1-10 kbp foreign DNA; and (2) a step for inserting the 0.1-10 kbp foreign DNA into a target site in the genome by genome editing through homologous recombination repair with the use of the donor plasmid obtained above.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
In recent years in the genome of a cell of the animal introduced site-specific modification technique, so-called genome editing technology is remarkably progressed. That is, in recent years, Zn-finger nuclease (ZFN), TALEN, genome editing technology such as CRISPR-Cas9 which becomes available, after cutting DNA homologous recombination repair (homology direct repair: HDR) using, a specific portion of the genome of a cell culture insert foreign DNA becomes available. By using this technique, an endogenous gene can be added to a tag such as GFP (non-patent document 1-7) becomes. On the other hand, in the single-stranded oligo DNA of 50-80b can have the homology region, the method of modifying the site-specific sequences have also been developed (non-patent document 7, 8). S2 Fly in a cell, utilizing a primer added homology PCR DNA fragment was amplified, foreign DNA insertion method is used as it is and has been developed (non-patent document 9). On the other hand, after cutting by genome editing HDR genome without using the path, another path can be used in the repair pathway and tagged micro-homology end-joining (MMEJ) have also been developed a technique (non-patent document 10).
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
次の工程を有する動物細胞ゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
(1)0.1kbp~10kbpの外来DNAの上流及び下流に、ゲノム上の挿入を行う部位と相同な配列を有する100bp~300bpのDNAを結合したドナープラスミドを作成する工程。 (2)得られたドナープラスミドを用いた相同組換え修復によるゲノム編集により、ゲノムの目的とする部位に0.1kbp~10kbpの外来DNAを挿入する工程。
[請求項2]
動物細胞が、株化されたヒト由来細胞、株化されたマウス由来細胞、株化されたニワトリ由来細胞、ヒトES細胞、マウスES細胞、ヒトiPS細胞及びマウスiPS細胞から選ばれる細胞である請求項1に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
[請求項3]
動物細胞が、ヒトHCT116細胞、ヒトHT1080細胞、ヒトNALM6細胞、ニワトリDT40細胞、ヒトES細胞、ヒトiPS細胞、マウスES細胞及びマウスiPS細胞から選ばれる細胞である請求項1又は2に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
[請求項4]
相同組換え修復によるゲノム編集法が、CRISPR-Cas9システム、TALENシステム又はZnフィンガーヌクレアーゼシステムから選ばれる相同組換え修復を利用した外来DNA挿入法である請求項1~3のいずれか一項に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
[請求項5]
相同組換え修復によるゲノム編集法が、CRISPR-Cas9システムにより誘発される相同組換え修復を利用した外来DNA挿入法である請求項1~4のいずれか一項に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
[請求項6]
前記挿入ゲノム部位との相同配列DNAが、PCR又はDNA合成により得られるものである請求項1~5のいずれか一項に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
[請求項7]
外来DNAが、タグ付加外来DNA、プロモーター配列、転写終結配列、機能的遺伝子配列、薬剤選択マーカー遺伝子及びそれらの組み合わせから選ばれる外来DNAである請求項1~6のいずれか一項に記載のゲノム部位特異的外来DNA挿入方法。
[請求項8]
セーフハーバー座位にtransport inhibitor response 1(TIR1)をコードする遺伝子を含む染色体を有することを特徴とする細胞。
[請求項9]
前記セーフハーバー座位がAAVS1(the AAV integration site 1)遺伝子座である請求項8に記載の細胞。
[請求項10]
さらに、前記染色体が前記TIR1をコードする遺伝子に作動可能に連結された、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、又は組織特異的プロモーターを含む請求項8又は9に記載の細胞。
[請求項11]
前記染色体が前記TIR1をコードする遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む、請求項10に記載の細胞。
[請求項12]
前記誘導性プロモーターが、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター及びホルモン誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項11に記載の細胞。
[請求項13]
前記化学的誘導性プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、請求項12に記載の細胞。
[請求項14]
外来DNAの上流及び下流に連結されており、染色体上の挿入を行う部位と相同な配列を有する100~300bpのDNAを利用して、前記外来DNAの挿入が行われた染色体を有することを特徴とする細胞。
[請求項15]
さらに、前記染色体は、前記外来DNAの上流又は下流であって、前記100~300bpのDNAに挟まれた領域に連結された薬剤選択マーカー遺伝子を含む、請求項14に記載の細胞。
[請求項16]
目的タンパク質をコードする第一の遺伝子と、
前記第一の遺伝子の上流又は下流に連結されたMini-auxin-inducible degron(mAID)をコードする第二の遺伝子と、
を含む第一の染色体と、
セーフハーバー座位にTIR1をコードする遺伝子を含む第二の染色体と、
を有することを特徴とする細胞。
[請求項17]
前記第一の染色体は、前記第一の遺伝子及び前記第二の遺伝子の上流及び下流に連結されており、染色体上の挿入が行う部位と相同な配列を有する100~300bpのDNAを含む、請求項16に記載の細胞。
[請求項18]
前記第一の染色体は、第一の遺伝子及び前記第二の遺伝子の上流又は下流であって、前記100~300bpのDNAに挟まれた領域に連結された薬剤選択マーカー遺伝子を含む、請求項16又は17に記載の細胞。
[請求項19]
さらに、前記染色体が前記TIR1をコードする遺伝子に作動可能に連結された、誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター、ハウスキーピング遺伝子プロモーター、又は組織特異的プロモーターを含む、請求項16~18のいずれか一項に記載の細胞。
[請求項20]
前記染色体が前記TIR1をコードする遺伝子に作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む、請求項19に記載の細胞。
[請求項21]
前記誘導性プロモーターが、化学的誘導性プロモーター、熱ショック誘導性プロモーター、電磁気的誘導性プロモーター、核レセプター誘導性プロモーター及びホルモン誘導性プロモーターからなる群より選択される、請求項20に記載の細胞。
[請求項22]
前記化学的誘導性プロモーターがテトラサイクリン誘導性プロモーターである、請求項21に記載の細胞。
[請求項23]
請求項16~22のいずれか一項に記載の細胞を用いることを特徴とする目的タンパク質の分解方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • INTER-UNIVERSITY RESEARCH INSTITUTE CORPORATION RESEARCH ORGANIZATION OF INFORMATION AND SYSTEMS
  • Inventor
  • KANEMAKI Masato
  • NATSUME Toyoaki
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG

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