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METHOD FOR IDENTIFYING BIOACTIVE PROTEIN, AND BIOACTIVE PROTEIN OBTAINED BY SAID METHOD

Foreign code F170009076
File No. (S2015-1988-N64)
Posted date May 29, 2017
Country WIPO
International application number 2016JP077198
International publication number WO 2017047672
Date of international filing Sep 14, 2016
Date of international publication Mar 23, 2017
Priority data
  • P2015-180831 (Sep 14, 2015) JP
Title METHOD FOR IDENTIFYING BIOACTIVE PROTEIN, AND BIOACTIVE PROTEIN OBTAINED BY SAID METHOD
Abstract The purpose of the present invention is to provide a method for identifying a bioactive protein translated from an open reading frame (ORF) other than a mORF present in mRNA. This problem is solved by a method for identifying a bioactive protein that is characterized by identifying a bioactive protein-encoding ORF other than the main ORF in the mRNA of a eukaryote, said method including: (1) a step in which an expression vector containing a candidate ORF is introduced into a cell, and the vector-introduced cell is cultured; (2) a step in which a protein that binds to a candidate protein, which is translated from the candidate ORF, is detected by immunoprecipitating the candidate protein from the cultured cell; and (3) a step in which the candidate protein, for which another protein that binds to the candidate protein was detected, is determined to be a bioactive protein.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Eukaryotic protein gene transcribed from messenger RNA (hereinafter, referred to as mRNA) current, the open reading frame encoding a functional protein (Open Reading Frame: hereinafter, referred to as ORF) only have one to 1, that are considered . This is, having the structure operon, i.e. polycistronic bacterial gene is compared with the described, the principle of the current one large genetics 1. However, is the nucleotide sequence of a eukaryotic mRNA, the start codon and stop codon ORF region resides in the same frame, 1 there are a plurality of on one mRNA. In many mRNA on, one of the plurality of ORF ORF of the 1, significantly longer than the other ORF. In general, this is the longest ORF, physiologically active, biologically active protein having a cell function is believed to be the encoding.
Non-patent document 1 and 2 is, the main ORF (hereinafter, sometimes referred to as mORF) upstream of the initiation codon (upstream ORF: hereinafter, referred to as uORF) ORF is, involved in the regulation of translation mORF are reported. These translation protein, has a function of the translational control of an mORF is, itself does not have physiological activity. That is, from an animal, other than mORF ORF translated from protein with biological activity has not been found.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
真核生物のmRNAにおけるメインのオープンリーディングフレーム(ORF)以外の生理活性を有するタンパク質をコードしているORFを特定することを特徴とする生理活性タンパク質の同定方法であって、
(1)候補ORFを組み込んだ発現ベクターを細胞に導入し、導入された細胞を培養する工程であって、前記候補ORFの開始コドンが、AUG又はAUGの1つの塩基が他の塩基である非AUGであり、
(2)培養細胞から、候補ORFから翻訳される候補タンパク質に結合するタンパク質を検出する工程、
(3)候補タンパク質に結合する他のタンパク質が検出された候補タンパク質を生理活性タンパク質と判定する工程、
を含む生理活性タンパク質の同定方法。
[請求項2]
前記細胞培養工程(1)において、細胞培養液にプロテアソーム阻害剤又はリソソーム阻害剤を添加する、請求項1に記載の生理活性タンパク質の同定方法。
[請求項3]
前記結合タンパク質検出工程(2)の前に、予め候補ORFから翻訳される候補タンパク質の発現を検出し、発現量が多い候補ORFを選択する工程を含む、請求項1又は2に記載の生理活性タンパク質の同定方法。
[請求項4]
前記候補ORFが、
(a)候補ORFの開始コドンが、前記メインORFの開始コドンより5’UTR側に存在すること、
(b)候補ORFのコードするタンパク質が10アミノ酸以上であること、
(c)候補ORFが、1種の真核生物のmRNAにおけるメインORF以外のORFであり、前記候補ORFから翻訳されるアミノ酸配列が、他の1種又は2種以上の真核生物のmRNAにおけるメインORF以外のORFから翻訳されるアミノ酸配列に対して50%以上の同一性を有するORFであること、
(d)候補ORFの開始コドンがAUGであること、及び
(e)真核生物の細胞に発現しているペプチドを質量分析により分析し、得られたペプチドの分子量を用いて候補ORFのデータベースから一致するアミノ酸配列が検索されたORFであること、
からなる群から選択される1つ以上の条件を満たす、請求項1~3のいずれか一項に記載の生理活性タンパク質の同定方法。
[請求項5]
前記結合タンパク質検出工程(2)における、前記結合タンパク質を検出する方法が、免疫沈降、酵母ツーハイブリッド法、プロテインアレイ法、ペルオキシダーゼを用いたラベル法、及びBioID法からなる群から選択される方法である、請求項1~4のいずれか一項に記載の生理活性タンパク質の同定方法。
[請求項6]
前記真核生物が、哺乳類である、請求項1~5のいずれか一項に記載の生理活性タンパク質の同定方法。
[請求項7]
(1)配列番号1で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(2)配列番号1で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、育児行動の基盤となる精神活動の異常を抑制する機能を示すタンパク質、
(3)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、育児行動の基盤となる精神活動の異常を抑制する機能を示すタンパク質、あるいは、
(4)配列番号1で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、育児行動の基盤となる精神活動の異常を抑制する機能を示すタンパク質。
[請求項8]
(1)配列番号10又は11で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(2)配列番号10又は11で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、Peroxiredoxin 1との結合能を有するタンパク質、
(3)配列番号10又は11で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、Peroxiredoxin 1との結合能を有するタンパク質、あるいは、
(4)配列番号10又は11で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、Peroxiredoxin 1との結合能を有するタンパク質。
[請求項9]
(1)配列番号14又は15で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(2)配列番号14又は15で表されるアミノ酸配列を含み、しかも、Q Subcomponent Binding Proteinとの結合能を有するタンパク質、
(3)配列番号14又は15で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、しかも、Q Subcomponent Binding Proteinとの結合能を有するタンパク質、あるいは、
(4)配列番号14又は15で表されるアミノ酸配列において、1又は数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入、及び/又は付加されたアミノ酸配列を含み、しかも、Q Subcomponent Binding Proteinとの結合能を有するタンパク質。
[請求項10]
請求項7~9のいずれか一項に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[請求項11]
請求項10に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
[請求項12]
請求項10に記載のポリヌクレオチドを含む形質転換体。
[請求項13]
請求項7~9のいずれか一項に記載のタンパク質に結合する抗体又はその断片。
[請求項14]
請求項7に記載のタンパク質をコードする遺伝子の発現が部分的に又は完全に抑制されたノックアウト非ヒト動物又は細胞。
[請求項15]
請求項14に記載のノックアウト非ヒト動物又は細胞に、候補化合物を投与することを特徴とする、育児行動の基盤となる精神活動の異常を抑制する化合物のスクリーニング方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • TOKYO INSTITUTE OF TECHNOLOGY
  • LIFEIS INC.
  • Inventor
  • AIZAWA Yasunori
  • KITANO Shohei
  • KIDA Yuichiro
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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