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METHOD FOR MEASURING TYROSINE PHOSPHATASE AND TYROSINE KINASE ACTIVITY

Foreign code F170009095
File No. (S2015-1473-N0)
Posted date May 30, 2017
Country WIPO
International application number 2016JP078224
International publication number WO 2017061288
Date of international filing Sep 26, 2016
Date of international publication Apr 13, 2017
Priority data
  • P2015-198320 (Oct 6, 2015) JP
Title METHOD FOR MEASURING TYROSINE PHOSPHATASE AND TYROSINE KINASE ACTIVITY
Abstract Provided is a method for measuring tyrosine phosphatase and tyrosine kinase activity, as a high-sensitivity measuring method, which is suitable for high throughput and which uses a compound represented by general formula (I) (in the formula, A represents a conjugated ring; L represents a linker or the like having a labeling substance at an end; R1 represents a hydrogen atom or the like; and R2 and R3 each represent a hydrogen atom, an alkyl group or the like).
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Tyrosine kinase to phosphorylate a tyrosine residue in proteins is an enzyme, on the other hand tyrosine phosphatase phosphorylated tyrosine residues and a substrate, the enzyme which catalyzes the dephosphorylation of the insulin. Tyrosine kinase and tyrosine phosphatases play an important role in vivo and, abnormality in the expression of these enzymes are often the cause of the disease. For example, tyrosine kinase is EGFR (epidermal growth factor receptor), such as over-expressed in lung cancer or colon cancer and it has been known that, in addition, tyrosine phosphatase PTP1B be related to diabetes have been reported. For this reason, the activity of tyrosine kinase and tyrosine phosphatase is accurately measured, in the treatment of diseases involving these enzymes are important for establishing means.
The method of measuring the tyrosine kinase activity, are known and many, for example,32 Pmethod using a radioactive isotope (non-patent document 1), a method of using anti-phospho-antibody (non-patent document 2), using capillary electrophoresis method (non-patent document 3) and the like are known. On the other hand, for the measurement of the activity of tyrosine phosphatases, not much is known. As the method commonly used, the inorganic phosphate was quantified by the malachite green, then a method for estimating the activity (non-patent document 4) or p- nitrophenyl phosphate (pNPP) and tyrosine phosphatase tyrosine mimic such as phosphorylation reaction, a method of quantifying the dephosphorylated generating (non-patent document 5) is.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
以下の工程を含むことを特徴とするチロシンホスファターゼ活性の測定方法、
(1)測定対象とするチロシンホスファターゼとリン酸化チロシン残基を含むペプチドを反応させ、リン酸化チロシン残基を脱リン酸化する工程、
(2)脱リン酸化させたチロシン残基に、酸化剤及び金属触媒の存在下で、下記の一般式(I)
[化1]
〔式中、Aは共役環を表し、Lは水素原子を表すか、又は共役環上の任意の位置に存在する末端にクリック反応に用いられる官能基を有するリンカー又は末端に標識物質を有するリンカーを表し、R1は水素原子を表すか、共役環上の任意の位置に存在する1個の放射性同位体、若しくはクリック反応に用いられる官能基を表すか、又は共役環上の任意の位置に存在する1個若しくは2個のアミノ基、アセトアミド基、ヒドロキシ基、アルキル基、若しくはアルコキシ基を表し、R2及びR3は、それぞれ水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。〕
で表される化合物を結合させる工程、
(3)ペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物の量を測定し、その量からチロシンホスファターゼ活性を求める工程。
[請求項2]
一般式(I)で表される化合物が、下記の一般式(Ia)
[化2]
〔式中、Lは上記と同じ意味である。〕
で表される化合物であることを特徴とする請求項1に記載のチロシンホスファターゼ活性の測定方法。
[請求項3]
リン酸化チロシン残基を含むペプチドに蛍光物質を結合させ、一般式(I)で表される化合物と特異的に結合する担体を用いて、ペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物を単離し、前記蛍光物質によってペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物の量を測定することを特徴とする請求項1又は2に記載のチロシンホスファターゼ活性の測定方法。
[請求項4]
リン酸化チロシン残基を含むペプチドに蛍光物質を結合させ、一般式(I)で表される化合物に、前記蛍光物質とFRETペアを形成する蛍光物質又は前記蛍光物質に対するクエンチャーを結合させ、ペプチドに結合させた蛍光物質及び/又は一般式(I)で表される化合物に結合させた蛍光物質の蛍光の変化によって、ペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物の量を測定することを特徴とする請求項1又は2に記載のチロシンホスファターゼ活性の測定方法。
[請求項5]
リン酸化チロシン残基を含むペプチドと下記の一般式(I)
[化3]
〔式中、Aは共役環を表し、Lは水素原子を表すか、又は共役環上の任意の位置に存在する末端にクリック反応に用いられる官能基を有するリンカー又は末端に標識物質を有するリンカーを表し、R1は水素原子を表すか、共役環上の任意の位置に存在する1個の放射性同位体、若しくはクリック反応に用いられる官能基を表すか、又は共役環上の任意の位置に存在する1個若しくは2個のアミノ基、アセトアミド基、ヒドロキシ基、アルキル基、若しくはアルコキシ基を表し、R2及びR3は、それぞれ水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。〕
で表される化合物を含むことを特徴とするチロシンホスファターゼ活性測定用キット。
[請求項6]
一般式(I)で表される化合物が、下記の一般式(Ia)
[化4]
〔式中、Lは上記と同じ意味である。〕
で表される化合物であることを特徴とする請求項5に記載のチロシンホスファターゼ活性測定用キット。
[請求項7]
以下の工程を含むことを特徴とするチロシンホスファターゼ阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法、
(1)被験物質の存在下で、チロシンホスファターゼとリン酸化チロシン残基を含むペプチドを接触させる工程、
(2)チロシンホスファターゼと接触させたリン酸化チロシン残基を含むペプチドを、酸化剤及び金属触媒の存在下で、下記の一般式(I)
[化5]
〔式中、Aは共役環を表し、Lは水素原子を表すか、又は共役環上の任意の位置に存在する末端にクリック反応に用いられる官能基を有するリンカー又は末端に標識物質を有するリンカーを表し、R1は水素原子を表すか、共役環上の任意の位置に存在する1個の放射性同位体、若しくはクリック反応に用いられる官能基を表すか、又は共役環上の任意の位置に存在する1個若しくは2個のアミノ基、アセトアミド基、ヒドロキシ基、アルキル基、若しくはアルコキシ基を表し、R2及びR3は、それぞれ水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。〕
で表される化合物と接触させる工程、
(3)ペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物の量を測定し、その量からチロシンホスファターゼ活性を求める工程。
[請求項8]
一般式(I)で表される化合物が、下記の一般式(Ia)
[化6]
〔式中、Lは上記と同じ意味である。〕
で表される化合物であることを特徴とする請求項7に記載のチロシンホスファターゼ阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法。
[請求項9]
リン酸化チロシン残基を含むペプチドに蛍光物質を結合させ、一般式(I)で表される化合物と特異的に結合する担体を用いて、ペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物を単離し、ペプチドに結合した蛍光物質によって一般式(I)で表される化合物の量を測定することを特徴とする請求項7又は8に記載のチロシンホスファターゼ阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法。
[請求項10]
リン酸化チロシン残基を含むペプチドに蛍光物質を結合させ、一般式(I)で表される化合物に、前記蛍光物質とFRETペアを形成する蛍光物質又は前記蛍光物質に対するクエンチャーを結合させ、ペプチドに結合させた蛍光物質及び/又は一般式(I)で表される化合物に結合させた蛍光物質の蛍光の変化によって、ペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物の量を測定することを特徴とする請求項7又は8に記載のチロシンホスファターゼ阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法。
[請求項11]
リン酸化チロシン残基を含むペプチドと下記の一般式(I)
[化7]
〔式中、Aは共役環を表し、Lは水素原子を表すか、又は共役環上の任意の位置に存在する末端にクリック反応に用いられる官能基を有するリンカー又は末端に標識物質を有するリンカーを表し、R1は水素原子を表すか、共役環上の任意の位置に存在する1個の放射性同位体、若しくはクリック反応に用いられる官能基を表すか、又は共役環上の任意の位置に存在する1個若しくは2個のアミノ基、アセトアミド基、ヒドロキシ基、アルキル基、若しくはアルコキシ基を表し、R2及びR3は、それぞれ水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。〕
で表される化合物を含むことを特徴とする糖尿病の診断薬。
[請求項12]
一般式(I)で表される化合物が、下記の一般式(Ia)
[化8]
〔式中、Lは上記と同じ意味である。〕
で表される化合物であることを特徴とする請求項11に記載の糖尿病の診断薬。
[請求項13]
以下の工程を含むことを特徴とするチロシンキナーゼ活性の測定方法、
(1)測定対象とするチロシンキナーゼと非リン酸化チロシン残基を含むペプチドを反応させ、非リン酸化チロシン残基をリン酸化する工程、
(2)リン酸化しなかったチロシン残基に、酸化剤及び金属触媒の存在下で、下記の一般式(I)
[化9]
〔式中、Aは共役環を表し、Lは水素原子を表すか、又は共役環上の任意の位置に存在する末端にクリック反応に用いられる官能基を有するリンカー又は末端に標識物質を有するリンカーを表し、R1は水素原子を表すか、共役環上の任意の位置に存在する1個の放射性同位体、若しくはクリック反応に用いられる官能基を表すか、又は共役環上の任意の位置に存在する1個若しくは2個のアミノ基、アセトアミド基、ヒドロキシ基、アルキル基、若しくはアルコキシ基を表し、R2及びR3は、それぞれ水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。〕
で表される化合物を結合させる工程、
(3)工程(2)においてペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物の量を測定する工程、
(4)工程(1)で使用した非リン酸化チロシン残基を含むペプチドの非リン酸化チロシン残基に、酸化剤及び金属触媒の存在下で、一般式(I)で表される化合物を結合させる工程、
(5)工程(4)においてペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物の量を測定する工程、
(6)工程(3)で測定したペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物の量と工程(5)で測定したペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物の量からチロシンキナーゼ活性を求める工程。
[請求項14]
一般式(I)で表される化合物が、下記の一般式(Ia)
[化10]
〔式中、Lは上記と同じ意味である。〕
で表される化合物であることを特徴とする請求項13に記載のチロシンキナーゼ活性の測定方法。
[請求項15]
非リン酸化チロシン残基を含むペプチドに蛍光物質を結合させ、一般式(I)で表される化合物と特異的に結合する担体を用いて、ペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物を単離し、前記蛍光物質によってペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物の量を測定することを特徴とする請求項13又は14に記載のチロシンキナーゼ活性の測定方法。
[請求項16]
非リン酸化チロシン残基を含むペプチドに蛍光物質を結合させ、一般式(I)で表される化合物に、前記蛍光物質とFRETペアを形成する蛍光物質又は前記蛍光物質に対するクエンチャーを結合させ、ペプチドに結合させた蛍光物質及び/又は一般式(I)で表される化合物に結合させた蛍光物質の蛍光の変化によって、ペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物の量を測定することを特徴とする請求項13又は14に記載のチロシンキナーゼ活性の測定方法。
[請求項17]
非リン酸化チロシン残基を含むペプチドと下記の一般式(I)
[化11]
〔式中、Aは共役環を表し、Lは水素原子を表すか、又は共役環上の任意の位置に存在する末端にクリック反応に用いられる官能基を有するリンカー又は末端に標識物質を有するリンカーを表し、R1は水素原子を表すか、共役環上の任意の位置に存在する1個の放射性同位体、若しくはクリック反応に用いられる官能基を表すか、又は共役環上の任意の位置に存在する1個若しくは2個のアミノ基、アセトアミド基、ヒドロキシ基、アルキル基、若しくはアルコキシ基を表し、R2及びR3は、それぞれ水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。〕
で表される化合物を含むことを特徴とするチロシンキナーゼ活性測定用キット。
[請求項18]
一般式(I)で表される化合物が、下記の一般式(Ia)
[化12]
〔式中、Lは上記と同じ意味である。〕
で表される化合物であることを特徴とする請求項17に記載のチロシンキナーゼ活性測定用キット。
[請求項19]
以下の工程を含むことを特徴とするチロシンキナーゼ阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法、
(1)被験物質の存在下で、チロシンキナーゼと非リン酸化チロシン残基を含むペプチドを接触させる工程、
(2)チロシンキナーゼと接触させた非リン酸化チロシン残基を含むペプチドを、酸化剤及び金属触媒の存在下で、下記の一般式(I)
[化13]
〔式中、Aは共役環を表し、Lは水素原子を表すか、又は共役環上の任意の位置に存在する末端にクリック反応に用いられる官能基を有するリンカー又は末端に標識物質を有するリンカーを表し、R1は水素原子を表すか、共役環上の任意の位置に存在する1個の放射性同位体、若しくはクリック反応に用いられる官能基を表すか、又は共役環上の任意の位置に存在する1個若しくは2個のアミノ基、アセトアミド基、ヒドロキシ基、アルキル基、若しくはアルコキシ基を表し、R2及びR3は、それぞれ水素原子、アルキル基、置換基を有していてもよい芳香族基を表す。〕
で表される化合物と接触させる工程、
(3)工程(2)においてペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物の量を測定する工程、
(4)工程(1)で使用した非リン酸化チロシン残基を含むペプチドを、酸化剤及び金属触媒の存在下で、一般式(I)で表される化合物と接触させる工程、
(5)工程(4)においてペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物の量を測定する工程、
(6)工程(3)で測定したペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物の量と工程(5)で測定したペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物の量からチロシンキナーゼ活性を求める工程。
[請求項20]
一般式(I)で表される化合物が、下記の一般式(Ia)
[化14]
〔式中、Lは上記と同じ意味である。〕
で表される化合物であることを特徴とする請求項19に記載のチロシンキナーゼ阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法。
[請求項21]
非リン酸化チロシン残基を含むペプチドに蛍光物質を結合させ、一般式(I)で表される化合物と特異的に結合する担体を用いて、ペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物を単離し、ペプチドに結合した蛍光物質によって一般式(I)で表される化合物の量を測定することを特徴とする請求項19又は20に記載のチロシンキナーゼ阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法。
[請求項22]
非リン酸化チロシン残基を含むペプチドに蛍光物質を結合させ、一般式(I)で表される化合物に、前記蛍光物質とFRETペアを形成する蛍光物質又は前記蛍光物質に対するクエンチャーを結合させ、ペプチドに結合させた蛍光物質及び/又は一般式(I)で表される化合物に結合させた蛍光物質の蛍光の変化によって、ペプチドに結合した一般式(I)で表される化合物の量を測定することを特徴とする請求項19又は20に記載のチロシンキナーゼ阻害剤又は活性化剤のスクリーニング方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • TOKYO INSTITUTE OF TECHNOLOGY
  • Inventor
  • SATO, Shinichi
  • NAKAMURA, Hiroyuki
  • NAKANO, Hirofumi
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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