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SCREENING METHOD FOR SINGLE-CHAIN ANTIBODIES, AND SINGLE-CHAIN ANTIBODIES

Foreign code F170009103
File No. (S2016-0105-N0)
Posted date Jun 14, 2017
Country WIPO
International application number 2016JP082988
International publication number WO 2017082214
Date of international filing Nov 7, 2016
Date of international publication May 18, 2017
Priority data
  • P2015-219765 (Nov 9, 2015) JP
  • P2016-024016 (Feb 10, 2016) JP
Title SCREENING METHOD FOR SINGLE-CHAIN ANTIBODIES, AND SINGLE-CHAIN ANTIBODIES
Abstract The present invention addresses the problem of providing: a screening method for single-chain antibodies having an extremely large capacity to bind with antigens, said method having excellent separation efficiency; and single-chain antibodies obtained using said screening method. This problem is solved by a screening method for single-chain antibodies that bind to antigens, said method comprising a step in which antigens bound to multilamellar liposomes are prepared, a step in which a phage library that displays single-chain antibodies is prepared, and a step in which phages displaying single-chain antibodies that bind to the antigens bound to the multilamellar liposomes are selected from the phage library.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
In the form of a molecular target drug, antibody pharmaceutical, a medicament including a low molecular weight, peptide pharmaceuticals, as well as in vivo protein therapeutic such as cytokines, siRNA, aptamers, various studies, have been developed (for example, patent document 1). The use of antibodies as therapeutic agents, from its specificity, diseased cells expressing the specific antigen useful in the treatment of a disease. Antibody, a protein as an antigen expressed on the cell surface bound, the bound cells were effectively acts. Antibody, longer half-life in blood, specifically to the antigen having a feature of higher degree, is also very useful as antitumor agents.
As a method for obtaining such an antibody, an antibody library using a panning ('gold dust can wash the sand from' the 'panning' is referred to as likened to.) By known technology for acquiring antibodies. For example, the variable regions of a human single-chain antibody (scFv) by phage display method as expressed on the surface of, a method for selecting phages binding to antigen is known. Selected phage gene with respect to the horizontal, which binds to an antigen of a human antibody variable region encoding DNA sequence can be determined. DNA sequence of scFv that binds to an antigen if clear, the obtained sequence is incorporated into an appropriate expression vector, human antibodies can be easily manufactured (for example, Patent Document 2, 3).
In this way, an antibody library by panning using antibody antibody pharmaceuticals such as a candidate of the known method of acquiring. However, in the art, when coupling a phage antigen, antigen of a polystyrene tube or plate normally fixed, blocking or if operation is needed, and the like adsorbed to the tube and which may cause protein denaturation. As a result, some of the phage library, or a protein using the blocking those which bind to the denatured protein occurs, for the purpose of phage binding to an antigen on an antigen other than acquisition of a problem.
On the other hand, a method of obtaining the antibody described above on the other hand, multilamellar liposomes from peptide libraries using those peptides that bind to a particular antibody has been developed a method for obtaining (non-patent document 1). This document also discloses that, as a model, multilamellar liposomes by an immobilized anti-octapeptide (FVNQHLCK, SEQ ID NO:35) to the antibodies, by phage display method is expressed on the surface for a peptide library applied the, octapeptide (FVNQHLCK, SEQ ID NO:35) can be selectively acquired have been identified.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
多重膜リポソームに結合した抗原を準備する工程、
単鎖抗体を提示するファージライブラリを準備する工程、及び
前記ファージライブラリから、前記多重膜リポソームに結合した抗原に結合する単鎖抗体を提示するファージを選択する工程
を含む、抗原に結合する単鎖抗体のスクリーニング方法。
[請求項2]
前記単鎖抗体が前記抗原に対して1.5×10-2s-1以下の解離速度定数を有する、請求項1に記載の方法。
[請求項3]
前記単鎖抗体がウサギ由来である、請求項1又は2に記載の方法。
[請求項4]
前記抗原がタンパク質である、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
[請求項5]
前記タンパク質が抗体である、請求項4に記載の方法。
[請求項6]
前記抗体がヒト血清由来IgGポリクローナル抗体又はヒト血清由来IgAポリクローナル抗体である、請求項5に記載の方法。
[請求項7]
前記単鎖抗体がヒト由来抗体のL鎖に結合する単鎖抗体である、請求項5又は6に記載の方法。
[請求項8]
前記タンパク質がエクソソーム由来タンパク質を含む、請求項4に記載の方法。
[請求項9]
前記タンパク質が、Sf9細胞株由来CD9のExtracellular Domain 2 (EC2)部分のみとヒト抗体のFcドメインとの融合タンパク質である、請求項8に記載の方法。
[請求項10]
前記タンパク質がウイルス由来タンパク質である、請求項4に記載の方法。
[請求項11]
前記ウイルス由来タンパク質がインフルエンザウイルス由来タンパク質である、請求項10に記載の方法。
[請求項12]
前記インフルエンザウイルス由来タンパク質がB型インフルエンザウイルス由来タンパク質である、請求項11に記載の方法。
[請求項13]
前記B型インフルエンザウイルス由来タンパク質がB型インフルエンザウイルス由来Nucleotide-binding Protein である、請求項12に記載の方法。
[請求項14]
前記タンパク質が炎症性タンパク質である、請求項4に記載の方法。
[請求項15]
前記炎症性タンパク質がヒト由来炎症性タンパク質C-reactive Protein (CRP)である、請求項14に記載の方法。
[請求項16]
請求項1~15のいずれか1項に記載のスクリーニング方法によりスクリーニングする工程、
スクリーニングされた単鎖抗体のアミノ酸配列を決定する工程、
決定されたアミノ酸配列の可変領域の配列に基づき、抗体をコードするDNA配列を作成する工程、及び
作成されたDNA配列を宿主細胞で発現させる工程
を含む、抗体の製造方法。
[請求項17]
抗体をコードするDNA配列がヒト化抗体をコードする請求項16に記載の製造方法。
[請求項18]
ヒト血清由来IgGポリクローナル抗体に対して3.0×10-8M以下の解離定数を有する単鎖抗体。
[請求項19]
さらに、ヒト血清由来IgAポリクローナル抗体に結合する、請求項18に記載の単鎖抗体。
[請求項20]
ヒト血清由来IgAポリクローナル抗体に対して1.0×10-3s-1以下の解離速度定数を有する単鎖抗体。
[請求項21]
ヒト由来抗体のL鎖に対して1.0×10-3s-1以下の解離速度定数を有する単鎖抗体。
[請求項22]
エクソソーム由来タンパク質を含むタンパク質に対して8.0×10-3s-1以下の解離速度定数を有する単鎖抗体。
[請求項23]
前記タンパク質が、Sf9細胞株由来CD9のExtracellular Domain 2 (EC2)部分のみとヒト抗体のFcドメインとの融合タンパク質である、請求項22に記載の単鎖抗体。
[請求項24]
ウイルス由来タンパク質に対して1.0×10-2s-1以下の解離速度定数を有する単鎖抗体。
[請求項25]
前記ウイルス由来タンパク質がインフルエンザウイルス由来タンパク質である、請求項24に記載の単鎖抗体。
[請求項26]
前記インフルエンザウイルス由来タンパク質がB型インフルエンザウイルス由来タンパク質である、請求項25に記載の鎖抗体。
[請求項27]
前記B型インフルエンザウイルス由来タンパク質がB型インフルエンザウイルス由来Nucleotide-binding Proteinである、請求項26に記載の単鎖抗体。
[請求項28]
炎症性タンパク質に対して1.0×10-2s-1以下の解離速度定数を有する単鎖抗体。
[請求項29]
前記炎症性タンパク質がC-reactive Protein (CRP)である、請求項28に記載の単鎖抗体。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • KYOTO INSTITUTE OF TECHNOLOGY
  • Inventor
  • KUMADA, Yoichi
  • HASEGAWA, Yuya
  • UCHIMURA, Seiichi
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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