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LIGAND FLUORESCENT SENSOR PROTEIN AND USE THEREOF

Foreign code F170009106
File No. (S2016-0169-N0)
Posted date Jun 15, 2017
Country WIPO
International application number 2016JP085902
International publication number WO 2017094885
Date of international filing Dec 2, 2016
Date of international publication Jun 8, 2017
Priority data
  • P2015-237524 (Dec 4, 2015) JP
  • 201662340533 (May 24, 2016) US
Title LIGAND FLUORESCENT SENSOR PROTEIN AND USE THEREOF
Abstract The present invention involves a ligand fluorescent sensor protein that specifically responds to ligands, leading to a change in fluorescence properties. The ligand fluorescent sensor protein includes a first fluorescent protein domain, an N terminal-side linker, a ligand-bonding domain, a C terminal-side linker, and a second fluorescent protein domain. The fluorescent protein used in the ligand fluorescent sensor protein has a β-barrel structure. The first fluorescent protein domain includes a β1–β3 β-sheet region from the N-terminal of the fluorescent protein, an α-helix region continuing therefrom, and a β4–β6 β-sheet region. The second fluorescent protein domain includes a β7–β11 β-sheet region of the same fluorescent protein as the first fluorescent protein domain. The N-terminal-side linker and the C-terminal-side linker are each independently a polypeptide comprising one or a plurality of amino acids.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Fluorescence vital imaging is, observed the inside of the living tissue or organ, and the molecular weight of live cells where the kinetics of new studies as a method of real-time analysis. Fluorescence imaging and optical equipment in recent years by technological innovation, various tissue or organ, a wide variety of biological phenomenon by applying fluorescent biological imaging, and live cells to the position of the motions of molecules become.
Fluorescence vital in imaging, a molecule (ligand) existing within the cell receptor that binds to the specific use, the movement of the living tissue or organ to which a ligand can be detected. Specifically, as a receptor, for example, in vivo antibody that binds to a molecule that binds specifically to the antibody present in the organism or antigen, or a specific substrate for the enzyme to a particular enzyme on the substrate, or ATP, cAMP, or cGMP binding domain of the molecule in the living body such as a fluorescent sensor proteins can be used in the like, the concentration of the ligand of a cell or within a time-varying distribution can be analyzed to visualize (space-time dynamics).
Protein is a fluorescent sensor, a single type, the ratio-type, and FRET (fluorescence resonance energy transfer) is largely classified into a type. A single type, each of the fluorescent sensor protein that is specified for the fluorescence intensity at a single wavelength changes depending on the concentration of the ligand type. The ratio-type is, for each identified protein 2 each fluorescent sensor at the fluorescence wavelength of one of the relative intensity ratio changes depending on the concentration of the ligand type. FRET type, different fluorophore 2 protein fragment of a fusion protein comprising a fragment of one when the excited state, depending on the concentration of the other fragment of the ligand is neared to the distance, the other of the excited state energy from the fragment to the fragment of a non-radiative transition Forster Resonance Energy (Forster resonance energy transfer) using the phenomenon that the, the concentration of the ligand to the former fragment fluorescence intensity and relative intensity of the fluorescence intensity of the latter fragment type ratio changes. For example, up to now, a single type (for example, see non-patent document 1), FRET-type (for example, see non-patent document 2), and the ratio-type (for example, non-patent document 3, reference 4) of the fluorescent sensor protein ATP have been reported.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
リガンドに特異的に応答して蛍光特性が変化するリガンド蛍光センサータンパク質であって、
前記リガンド蛍光センサータンパク質は、第1の蛍光タンパク質ドメインと、N末端側リンカーと、リガンド結合ドメインと、C末端側リンカーと、第2の蛍光タンパク質ドメインとを含み、
前記リガンド蛍光センサータンパク質に用いられる蛍光タンパク質がβバレル構造を有するものであり、
前記第1の蛍光タンパク質ドメインが前記蛍光タンパク質のN末端からβ1~β3のβシート領域と、これに続くαへリックス領域と、β4~β6のβシート領域とを含み、
前記第2の蛍光タンパク質ドメインが前記第1の蛍光タンパク質ドメインと同一の前記蛍光タンパク質のβ7~β11のβシート領域を含み、
前記N末端側リンカー及び前記C末端側リンカーは、それぞれ独立して1個又は数個のアミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とするリガンド蛍光センサータンパク質。
[請求項2]
前記蛍光タンパク質がBFP、GFP、Citrine、又はmAppleである請求項1に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
[請求項3]
前記リガンド蛍光センサータンパク質は、N末端からC末端に向かって、第1の蛍光タンパク質ドメインと、N末端側リンカーと、リガンド結合ドメインと、C末端側リンカーと、第2の蛍光タンパク質ドメインとが、直接この順番にペプチド結合で連結してなるポリペプチドを含む請求項1又は2に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
[請求項4]
前記リガンド蛍光センサータンパク質は、2つのリガンド結合ドメインを含み、
N末端からC末端に向かって、第1のリガンド結合ドメインと、N末端側リンカーと、第2の蛍光タンパク質ドメインと、第1の蛍光タンパク質ドメインと、C末端側リンカーと、第2のリガンド結合ドメインと、が、直接この順番にペプチド結合で連結してなるポリペプチドを含む請求項1又は2に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
[請求項5]
前記第1の蛍光タンパク質ドメインは、以下の(B1)~(B3)のいずれかのポリペプチドを含み、
前記第2の蛍光タンパク質ドメインは、以下の(C1)~(C3)のいずれかのポリペプチドを含み、
前記第1の蛍光タンパク質ドメインと第2の蛍光タンパク質ドメインとが同一の蛍光タンパク質に由来する請求項1又は2に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
(B1)配列番号1、3、5、又は7で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(B2)配列番号1、3、5、又は7で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、前記第2の蛍光タンパク質ドメインとβバレル構造を形成し、蛍光を発するポリペプチド、
(B3)配列番号1、3、5、又は7で表されるアミノ酸配列と同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、前記第2の蛍光タンパク質ドメインとβバレル構造を形成し、蛍光を発するポリペプチド、
(C1)配列番号2、4、6、又は8で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(C2)配列番号2、4、6、又は8で表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、前記第1の蛍光タンパク質ドメインとβバレル構造を形成し、蛍光を発するポリペプチド、
(C3)配列番号2、4、6、又は8で表されるアミノ酸配列と同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、前記第1の蛍光タンパク質ドメインとβバレル構造を形成し、蛍光を発するポリペプチド
[請求項6]
前記リガンドが、ヌクレオチド若しくはその誘導体、核酸、糖鎖、タンパク質、脂質複合体、又は低分子化合物である請求項1~5のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
[請求項7]
前記ヌクレオチド若しくはその誘導体が、ATP、cAMP、又はcGMPである請求項6に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
[請求項8]
前記タンパク質が抗原又は抗体である請求項6に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
[請求項9]
以下の(D1)~(D3)のいずれかのポリペプチドを含む請求項1~8のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
(D1)配列番号9~14のいずれかで表されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(D2)配列番号9~14のいずれかで表されるアミノ酸配列において、1若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含み、且つ、前記ポリペプチド(D1)と同一の、リガンドへの結合能及び蛍光特性を有するポリペプチド、
(D3)配列番号9~14のいずれかで表されるアミノ酸配列と同一性が80%以上であるアミノ酸配列を含み、且つ、前記ポリペプチド(D1)と同一の、リガンドへの結合能及び蛍光特性を有するポリペプチド
[請求項10]
さらに、オルガネラ局在化シグナルペプチドを含む請求項1~9のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
[請求項11]
前記オルガネラ局在化シグナルペプチドがミトコンドリア局在化シグナルペプチドである請求項10に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
[請求項12]
前記オルガネラ局在化シグナルペプチドが核局在化シグナルペプチドである請求項10に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
[請求項13]
さらに、細胞膜透過性ペプチドを含む請求項1~12のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質。
[請求項14]
請求項1~13のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質をコードすることを特徴とするポリヌクレオチド。
[請求項15]
請求項14に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする発現ベクター。
[請求項16]
請求項1~13のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質を少なくとも1種類含むことを特徴とする細胞。
[請求項17]
請求項1~13のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質をコードするポリヌクレオチドを少なくとも1種類含む染色体を有することを特徴とする細胞。
[請求項18]
請求項15に記載の発現ベクターを少なくとも1種類含むことを特徴とする細胞。
[請求項19]
請求項16~18のいずれか一項に記載の細胞を含むことを特徴とする非ヒト生物。
[請求項20]
請求項1~13のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質、請求項14に記載のポリヌクレオチド、請求項15に記載の発現ベクター、請求項16~18のいずれか一項に記載の細胞、及び請求項19に記載の非ヒト生物からなる群から選ばれる少なくとも一つを含むことを特徴とするリガンド濃度測定用キット。
[請求項21]
請求項1~13のいずれか一項に記載のリガンド蛍光センサータンパク質と、既知の濃度のリガンドを含む標準溶液と接触させて、蛍光強度を測定し、検量線を作成する検量線作成工程と、
前記リガンド蛍光センサータンパク質と、未知の濃度のリガンドを含む溶液と接触させて、蛍光強度を測定する蛍光測定工程と、
前記検量線作成工程において、作成された検量線に基づいて、前記蛍光測定工程において測定された蛍光強度に対するリガンド濃度を決定する濃度決定工程と、
を備えることを特徴とする被検試料中のリガンド濃度の決定方法。
[請求項22]
請求項16~18のいずれか一項に記載の細胞を用いて、経時的な蛍光強度を測定する工程を備えることを特徴とする生細胞におけるリガンド濃度の経時変化の検知方法。
[請求項23]
請求項19に記載の非ヒト生物を用いて、経時的な蛍光強度を測定する工程を備えることを特徴とする生きた非ヒト生物におけるリガンド濃度の経時変化の検知方法。
[請求項24]
ATP濃度に特異的に応答して蛍光特性が変化するATP蛍光センサータンパク質であって、該ATP蛍光センサータンパク質は、N末端からC末端に向けて、第1の蛍光タンパク質ドメインと、N末端側リンカーと、ATP結合ドメインと、C末端側リンカーと、第2の蛍光タンパク質ドメインとが、直接この順にペプチド結合で連結したポリペプチドを含み、該ポリペプチドは、
第1の蛍光タンパク質ドメインは、蛍光タンパク質BFP、Citrine又はmAppleのN末端から、β1~β3のβシート領域と、これに続くαヘリックス領域と、β4~β6のβシート領域とを含み、
第2の蛍光タンパク質ドメインは、第1の蛍光タンパク質ドメインと同一の蛍光タンパク質のβ7~β11のβシート領域を含み、
ATP結合ドメインはF0F1-ATP合成酵素のεサブユニットからなり、
N末端側リンカー及びC末端側リンカーは、それぞれ、1個又は数個のアミノ酸からなるポリペプチドであることを特徴とするATP蛍光センサータンパク質。
[請求項25]
(A11)ATP結合ドメインは配列番号15のアミノ酸配列であり、第1及び第2の蛍光タンパク質ドメインは、それぞれ、配列番号1及び2のアミノ酸配列であり、N末端及びC末端側のリンカーは、それぞれ、配列番号16及び17のアミノ酸配列である、MaLion Bポリペプチドと、
(A12)ATP結合ドメイン、第1の蛍光タンパク質ドメイン、第2の蛍光タンパク質ドメイン、N末端側のリンカー、及びC末端側のリンカーは、それぞれ独立に、配列番号15、1、2、16、及び17のアミノ酸配列か、配列番号13、1、2、14、及び15のアミノ酸配列に1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換、又は付加されたアミノ酸配列かであり、かつ、MaLion Bポリペプチド(A11)と同一のATP結合能及び蛍光特性を有する、MaLion Bポリペプチドと、
(B11)ATP結合ドメインは配列番号15のアミノ酸配列であり、第1及び第2の蛍光タンパク質ドメインは、それぞれ、配列番号5及び6のアミノ酸配列であり、N末端及びC末端側のリンカーは、それぞれ、WRG(Trp-Arg-Gly)及び配列番号18のアミノ酸配列である、MaLion Gポリペプチドと、
(B12)ATP結合ドメイン、第1の蛍光タンパク質ドメイン、第2の蛍光タンパク質ドメイン、N末端側のリンカー及びC末端側のリンカーは、それぞれ独立に、配列番号15、5、6、WRG(Trp-Arg-Gly)、及び配列番号18のアミノ酸配列か、配列番号15、5、6、WRG(Trp-Arg-Gly)、及び配列番号18のアミノ酸配列に1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列かであり、かつ、MaLion Gポリペプチド(B11)と同一のATP結合能及び蛍光特性を有する、MaLion Gポリペプチドと、
(C11)ATP結合ドメインは配列番号15のアミノ酸配列であり、第1及び第2の蛍光タンパク質ドメインは、それぞれ、配列番号7及び8のアミノ酸配列であり、N末端及びC末端側のリンカーは、それぞれ、配列番号19及びPEE(Pro-Glu-Glu)のアミノ酸配列である、MaLion Rポリペプチドと、
(C12)ATP結合ドメイン、第1の蛍光タンパク質ドメイン、第2の蛍光タンパク質ドメイン、N末端側のリンカー及びC末端側のリンカーは、それぞれ、配列番号15、7、8、19、及びPEE(Pro-Glu-Glu)のアミノ酸配列か、配列番号15、7、8、19、及びPEE(Pro-Glu-Glu)のアミノ酸配列に1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列かであり、かつ、MaLion Rポリペプチド(C11)と同一のATP結合能及び蛍光特性を有する、MaLion Rポリペプチドとからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドを含む請求項24に記載のATP蛍光センサータンパク質。
[請求項26]
(A21)配列番号9のアミノ酸配列からなる、MaLion Bポリペプチドと、
(A22)配列番号9のアミノ酸配列のうち、配列番号16及び17のアミノ酸配列を除くアミノ酸配列に1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、MaLion Bポリペプチド(A21)と同一のATP結合能及び蛍光特性を有する、MaLion Bポリペプチドと、
(B21)配列番号10のアミノ酸配列からなる、MaLion Gポリペプチドと、
(B22)配列番号10のアミノ酸配列のうち、配列番号10の第146-148位のWRG(Trp-Arg-Gly)のアミノ酸配列と、配列番号18のアミノ酸配列とを除くアミノ酸配列に1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、MaLion Gポリペプチド(B21)と同一のATP結合能及び蛍光特性を有する、MaLion Gポリペプチドと、
(C21)配列番号11のアミノ酸配列からなる、MaLion Rポリペプチドと、
(C22)配列番号11のアミノ酸配列のうち、配列番号11の第288-290位のPEE(Pro-Glu-Glu)のアミノ酸配列と、配列番号19のアミノ酸配列とを除くアミノ酸配列に1個若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、MaLion Rポリペプチド(C21)と同一のATP結合能及び蛍光特性を有する、MaLion Rポリペプチドとからなる群から選択される少なくとも1つのポリペプチドを含む請求項24又は25に記載のATP蛍光センサータンパク質。
[請求項27]
請求項24~26のいずれか一項に記載のATP蛍光センサータンパク質を含むことを特徴とする蛍光組成物。
[請求項28]
前記ATP蛍光センサータンパク質は固体支持体に不動化される請求項27に記載の蛍光組成物。
[請求項29]
前記ATP蛍光センサータンパク質は、第1及び第2の蛍光タンパク質ドメインの対の異なる少なくとも2種類のATP蛍光センサータンパク質である請求項28に記載の蛍光組成物。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • THE UNIVERSITY OF TOKYO
  • WASEDA UNIVERSITY
  • Inventor
  • TSUBOI Takashi
  • KITAGUCHI Tetsuya
  • ARAI Satoshi
  • UEDA Hiroshi
IPC(International Patent Classification)

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