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GENETIC MODIFICATION NON-HUMAN ORGANISM, EGG CELLS, FERTILIZED EGGS, AND METHOD FOR MODIFYING TARGET GENES

Foreign code F170009118
File No. (AF37P001)
Posted date Jul 7, 2017
Country WIPO
International application number 2016JP085391
International publication number WO 2017104404
Date of international filing Nov 29, 2016
Date of international publication Jun 22, 2017
Priority data
  • P2015-247960 (Dec 18, 2015) JP
Title GENETIC MODIFICATION NON-HUMAN ORGANISM, EGG CELLS, FERTILIZED EGGS, AND METHOD FOR MODIFYING TARGET GENES
Abstract The present invention provides a genetic modification non-human organism where Cas9 expression is higher and a plurality of different genes, or a plurality of sites within the same gene, can be simultaneously edited with high efficiency. This genetic modification non-human organism has at least three copies of the gene encoding Cas9 (CRISPR-associated 9) within the nuclear genome. These egg cells are derived from a genetic modification non-human organism having a nuclear genome into which at least three copies of a gene encoding CAS9 have been introduced. These fertilized eggs are obtained by allowing fertilization to occur between the egg cells and sperm derived from an organism of the same species. This method for modifying a target gene comprises a step for introducing guide RNA to cells derived from the genetic modification non-human organism, the egg cells, or the fertilized eggs.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
The development of new drugs or the study of the mechanisms of the disease in the studies, reflecting the pathology of the disease the presence of disease model animals, holds a key to success or failure of the study. With respect to genetic factors of human disease, by the recent rapid development of technology for genome analysis, SNP locus spanning millions of locations and the genetic information can be obtained relatively easily as compared to the case. For numerous disorders using this technique, a large number of diseases associated with genetic loci have been identified, reported. On the other hand, such the genetically modified mouse of disease candidate genes may be prepared, in most cases do not exhibit the phenotype. This is, unusual for a single gene, such as life-style related diseases can be explained a disease involving a multi-factor is not certain. Therefore, each of these candidate genes for drug discovery that target considered to be a limit in the effect. To solve such problem, quickly multilocus modified disease model animals, prepared and systematically, but necessary to adjust a regime utilized, conventional ES cell that genetic modification method, operation 1, locus 1, cannot be genetically modified in the two places of 1 only, it is difficult to realize this.
In recent years, genetically modified CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) system with the advent of the technology. CRISPR system, through the genetic modification of the conventional ES cells having a potential for a novel transcendent techniques. CRISPR system, 3 types of RNA or DNA, a guide RNA of the target gene that is cut, the cutting device is engaged in a nuclease Cas9(CRISPR-associated 9) mRNA of, a gene region that cleavage of the gene is a modified integrated homologously into a fertilized egg to the microscopic injection type 3, by generating the embryonic to adulthood, the genetically modified mouse is obtained.
The non-patent document 1, the system can be used CRISPR, ES cells of the ROSA26 gene encoding the Cas9 gene region by knock-in, can manufacture knock-in mice Cas9 described.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
Cas9(CRISPR-associated 9)をコードする遺伝子が核ゲノム中に少なくとも3コピーを有することを特徴とする遺伝子改変非ヒト生物。
[請求項2]
前記Cas9が改変体である、請求項1に記載の遺伝子改変非ヒト生物。
[請求項3]
前記Cas9が標的配列を含む標的遺伝子の一方又は両方の鎖を切断する活性を欠如している改変体である、請求項2に記載の遺伝子改変非ヒト生物。
[請求項4]
さらに、前記核ゲノムが前記Cas9をコードする遺伝子に作動可能に連結された、CAGプロモーター、発現誘導性プロモーター、ウイルス性プロモーター又は組織特異的プロモーターを含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト生物。
[請求項5]
非ヒト生物が哺乳動物である、請求項1~4のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト生物。
[請求項6]
前記核ゲノムに前記Cas9をコードする遺伝子がタンデムに導入された、請求項1~5のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト生物。
[請求項7]
Cas9をコードする遺伝子が少なくとも3コピー導入された核ゲノムを有する遺伝子改変非ヒト生物由来であることを特徴とする卵細胞。
[請求項8]
前記卵細胞が核にCas9をコードする遺伝子が導入された核ゲノムを有さない、請求項7に記載の卵細胞。
[請求項9]
請求項7又は8に記載の卵細胞と、同種の生物由来の精子とを受精させてなることを特徴とする受精卵。
[請求項10]
前記卵細胞が核にCas9をコードする遺伝子が導入された核ゲノムを有さない、請求項9に記載の受精卵。
[請求項11]
前記精子が野生型の前記同種の生物由来である、請求項9又は10に記載の受精卵。
[請求項12]
請求項1~6のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト生物由来の細胞、請求項7又は8に記載の卵細胞、又は請求項9~11のいずれか一項に記載の受精卵にガイドRNAを導入する工程を備えることを特徴とする標的遺伝子の改変方法。
[請求項13]
請求項1~6のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト生物由来の細胞、請求項7又は8に記載の卵細胞、又は請求項9~11のいずれか一項に記載の受精卵にガイドRNAを導入する工程と、
前記遺伝子改変非ヒト生物由来の細胞、前記遺伝子改変非ヒト生物由来の卵細胞、又は前記遺伝子改変非ヒト生物由来の受精卵内において発現しているCas9がPAM(Proto-spacer Adjacent Motif)配列の上流に位置する切断部位で前記標的遺伝子を切断する工程と、
前記ガイドRNAと前記標的遺伝子の相補的結合によって決定される領域において、改変された前記標的遺伝子を得る工程と、を備え、
前記標的遺伝子は前記PAM配列を有し、
前記ガイドRNAは、前記標的遺伝子中の前記PAM配列の上流の塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものであることを特徴とする標的遺伝子の改変方法。
[請求項14]
請求項1~6のいずれか一項に記載の遺伝子改変非ヒト生物由来の細胞、請求項7又は8に記載の卵細胞、又は請求項9~11のいずれか一項に記載の受精卵にガイドRNAを導入する工程と、
前記遺伝子改変非ヒト生物由来の細胞、前記遺伝子改変非ヒト生物由来の卵細胞、又は前記遺伝子改変非ヒト生物由来の受精卵内において発現しているCas9がPAM配列の3塩基上流に位置する切断部位で前記標的遺伝子を切断する工程と、
前記ガイドRNAと前記標的遺伝子の相補的結合によって決定される領域において、改変された前記標的遺伝子を得る工程と、を備え、
前記標的遺伝子はNGG(Nは、アデニン、シトシン、チミン及びグアニンからなる群から選択された任意の1塩基)からなるPAM配列を有し、
前記ガイドRNAは、前記標的遺伝子中の前記PAM配列の1塩基上流から20塩基以上24塩基以下上流までの塩基配列に相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドを含むものであることを特徴とする標的遺伝子の改変方法。
[請求項15]
前記導入工程において、導入対象が遺伝子改変非ヒト生物由来の細胞であるとき、生きた遺伝子改変非ヒト生物にガイドRNAを導入する、請求項12~14のいずれか一項に記載の標的遺伝子の改変方法。
[請求項16]
前記導入工程において、導入対象が遺伝子改変非ヒト動物由来の受精卵であるとき、さらに、前記受精卵を同種の非ヒト動物の子宮又は卵管へ移植し、発生させる工程を備える、請求項12~14のいずれか一項に記載の標的遺伝子の改変方法。
[請求項17]
前記導入工程において、2種類以上の前記ガイドRNAを導入する、請求項12~16のいずれか一項に記載の標的遺伝子の改変方法。
[請求項18]
前記導入工程において、前記ガイドRNAとともに外来遺伝子を導入する、請求項12~17のいずれか一項に記載の標的遺伝子の改変方法。
[請求項19]
前記外来遺伝子がPAM配列を有さない、請求項18に記載の標的遺伝子の改変方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY
  • Inventor
  • SHINDO Takayuki
  • SAKURAI Takayuki
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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