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DIFFERENTIATION INDUCTION FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS INTO HYPOTHALAMIC NEURONS commons

Foreign code F170009139
File No. (S2016-0324-N0)
Posted date Aug 8, 2017
Country WIPO
International application number 2017JP001544
International publication number WO 2017126551
Date of international filing Jan 18, 2017
Date of international publication Jul 27, 2017
Priority data
  • P2016-010940 (Jan 22, 2016) JP
Title DIFFERENTIATION INDUCTION FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS INTO HYPOTHALAMIC NEURONS commons
Abstract Provided is a method for efficiently inducing differentiation from human pluripotent stem cells into hypothalamic neurons. Also provided is a method for constructing a cellular structure that integrates pituitary tissue and hypothalamic tissue from human pluripotent stem cells. A cellular structure including hypothalamic tissue is obtained by a method including a step for suspension culturing human pluripotent stem cell spheroids in a medium including a low concentration of an osteogenic factor signaling pathway activator and a low concentration of a substance capable of acting on the Shh signaling pathway, and a step for also suspension culturing the cell spheroids obtained in that step in a medium including a low concentration of a substance capable of acting on the Shh signaling pathway. A cellular structure including hypothalamic tissue and pituitary tissue is also obtained by a method including a step for suspension culturing human pluripotent stem cell spheroids in a medium including an osteogenic factor signaling pathway activator and a substance capable of acting on the Shh signaling pathway, a step for also suspension culturing the cell spheroids formed in that step in a medium including an osteogenic factor signaling pathway activator and a substance capable of acting on the Shh signaling pathway, and a step for suspension culturing the cell spheroids obtained in that step in a medium suitable for simultaneous pituitary and hypothalamic induction .
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
The hypothalamus, growth, puberty, metabolism, stress corresponding, reproductive, nursing warpage, immunity such, for maintaining the constancy of the human body in the central nervous. Particularly in recent years, due to the increase in life-style related diseases such as diabetes there is an increasing interest but control appetite, the feeding center that may be present in the hypothalamus. In addition, oxytocin is one of hypothalamic hormones, conventionally been with milk ejection, in addition to the effect of uterine contraction, trust relationship or affection related to report and has increased, quality of life of the human hormone has been found to be deeply involved.
Thereby inhibiting the abnormal and normal hypothalamus hormone secretion is not performed, diseases such as central diabetes insipidus, eating disorders, sleep disorders and the like are caused. Insufficiency due to an anomaly of the hypothalamus hormones for hormone replacement therapy is being performed. However, hormone replacement therapy is limited and, in many cases a sufficient effect cannot be obtained. Originally, the secretion amount of hormone to regulate the accommodate changes in environmental conditions. And adjusting mechanism such that a living body, the refilling from the outside is practically reproduced, impossible.
The depth of the hypothalamus and the brain, the small region is, used to study the actual tissue taken out is difficult. On the other hand, pluripotent stem cells such as ES cells produced from hypothalamic neurons has been attempted. For example, 2008 year Wataya et al., SFEBq method for adapting, producing cells from mouse ES cells to induce the differentiation of hypothalamic AVP method (non-patent document 1) has been established. Serum and growth factor SFEBq method using gfCDM medium does not include, non-adherent cells in the plate 3 and the three-dimensional suspension culture to agglomerate, to differentiate into neural tissue. 2015 In the year, the three-dimensional suspension culture Merkle et al. 3 and 2 using the method of two-dimensional plane culture type 2, human ES cells and iPS cells from the hypothalamus to induce the differentiation of neurons (non-patent document 2) has succeeded.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
以下のステップ(1)及び(2)を含む、視床下部組織を含む細胞構造体の製造方法:
(1)ヒト多能性幹細胞の凝集塊を、低濃度の骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及び低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養するステップ、
(2)ステップ(1)で得られた細胞凝集塊を、低濃度のShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ。
[請求項2]
ステップ(2)を高酸素分圧条件下で行う、請求項1に記載の製造方法。
[請求項3]
以下のステップ(3)を更に含む、請求項1又は2に記載の製造方法:
(3)ステップ(2)で得られた細胞凝集塊を回収し、細胞凝集塊を構成する細胞を分散培養するステップ。
[請求項4]
ステップ(3)を高酸素分圧条件下で行う、請求項3に記載の製造方法。
[請求項5]
ステップ(1)における前記骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質がBMP4であり、培地中のその濃度が0.1 nM~5.0 nMであり、
ステップ(1)及び(2)における前記Shhシグナル経路作用物質がSAGであり、培地中のその濃度が0.1μM~2.0μMであり、
前記ステップ(1)及び(2)によって背側視床下部組織への分化が誘導される、
請求項1~4のいずれか一項に記載の製造方法。
[請求項6]
前記背側視床下部組織はバゾプレシンニューロン、オキシトシンニューロン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモンニューロン、コルチコトロピン放出ホルモンニューロン及びニューロペプチドYニューロンからなる群より選択される一以上のニューロンを含む、請求項5に記載の製造方法。
[請求項7]
ステップ(1)における前記骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質がBMP4であり、培地中のその濃度が0.1 nM~3.0 nMであり、
ステップ(1)及び(2)における前記Shhシグナル経路作用物質がSAGであり、培地中のその濃度が0.1μM~2.0μMであり、
前記培地がAkt阻害剤を更に含み、
前記ステップ(1)及び(2)によって腹側視床下部組織への分化が誘導される、請求項1~4のいずれか一項に記載の製造方法。
[請求項8]
前記腹側視床下部組織はアグーチ関連タンパク質ニューロン、プロオピオメラノコルチンニューロン、メラニン凝集ホルモンニューロン及びOrexinニューロンからなる群より選択される一以上のニューロンを含む、請求項7に記載の製造方法。
[請求項9]
前記浮遊培養をフィーダー細胞の非存在下で行う、請求項1~8のいずれか一項に記載の製造方法。
[請求項10]
ステップ(1)における前記凝集塊が、分散させたヒト多能性幹細胞の浮遊培養によって形成される、請求項1~9のいずれか一項に記載の製造方法。
[請求項11]
前記浮遊培養を無血清凝集浮遊培養法で行う、請求項10に記載の製造方法。
[請求項12]
以下のステップ(i)~(iii)を含む、視床下部組織と下垂体組織を含む細胞構造体の製造方法:
(i)ヒト多能性幹細胞の凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で浮遊培養するステップ、
(ii)ステップ(i)で形成された細胞凝集塊を、骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質及びShhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ、
(iii)ステップ(ii)で得られた細胞凝集塊を、下垂体及び視床下部の同時誘導に適した培地中で浮遊培養するステップ
[請求項13]
ステップ(ii)及び(iii)を高酸素分圧条件下で行う、請求項12に記載の製造方法。
[請求項14]
ステップ(ii)とステップ(iii)の間に以下のステップ(a)を行い、ステップ(iii)ではステップ(a)で得られた細胞凝集塊を浮遊培養する、請求項12又は13に記載の製造方法:
(a)ステップ(ii)で得られた細胞凝集塊を、Shhシグナル経路作用物質を含む培地中で更に浮遊培養するステップ。
[請求項15]
ステップ(a)を高酸素分圧条件下で行う、請求項12~14のいずれか一項に記載の製造方法。
[請求項16]
前記浮遊培養をフィーダー細胞の非存在下で行う、請求項12~15のいずれか一項に記載の製造方法。
[請求項17]
ステップ(i)における前記凝集塊が、分散させたヒト多能性幹細胞の浮遊培養によって形成される、請求項12~16のいずれか一項に記載の製造方法。
[請求項18]
骨形成因子シグナル伝達経路活性化物質がBMP4である、請求項12~17のいずれか一項に記載の製造方法。
[請求項19]
Shhシグナル経路作用物質がSAGである、請求項12~18のいずれか一項に記載の製造方法。
[請求項20]
請求項1~19のいずれか一項に記載の製造方法で得られる細胞構造体。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • NAGOYA UNIVERSITY
  • Inventor
  • SUGA Hidetaka
  • OGAWA Koichiro
  • KASAI Takatoshi
  • ARIMA Hiroshi
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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