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VITRIFICATION STABILIZER FOR ANIMAL CELL CRYOPRESERVATION FLUID

Foreign code F170009159
File No. (S2016-0438-N0)
Posted date Aug 29, 2017
Country WIPO
International application number 2017JP005592
International publication number WO 2017141991
Date of international filing Feb 15, 2017
Date of international publication Aug 24, 2017
Priority data
  • P2016-027612 (Feb 17, 2016) JP
Title VITRIFICATION STABILIZER FOR ANIMAL CELL CRYOPRESERVATION FLUID
Abstract Provided are a vitrification stabilizer for an animal cell cryopreservation fluid, and an animal cell cryopreservation fluid which exhibits superior vitrification capabilities due to the animal cell cryopreservation fluid containing the vitrification stabilizer for an animal cell cryopreservation fluid. The vitrification stabilizer for an animal cell cryopreservation fluid contains: an amphoteric polymer compound selected from the group consisting of (a) a carboxylated amphoteric polymer compound obtained by reacting ε-poly-L-lysine with butyl succinic anhydride, (b) a carboxylated amphoteric polymer compound obtained by reacting ε-poly-L-lysine with butyl succinic anhydride and succinic anhydride, or (c) a carboxylated amphoteric polymer compound obtained by reacting ε-poly-L-lysine with a compound represented by formula I; and (d) a sucrose polymer macromolecule to which epichlorohydrin has been crosslinked.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
In recent years, clinical application of regenerative medicine is highly expected to. As the basic technique for this purpose, cells, cell sheets, three dimensional shape of the cell constructs, tissue, and stored frozen and there is a need. Such a technique, freezing protection substance is added, while preventing damage to the object, a technique of cryopreservation. Such as a cryo-protectant, dimethyl sulfoxide (DMSO) (O=S (CH3)2) 、known glycerin and the like.
DMSO or glycerol and is, in a cell dispersed for use in cryopreservation, sufficient is the same. However, is DMSO or glycerol, a cell sheet, cell constructs three-dimensional shape, such as in use with the tissue for cryopreservation, often the damage state after thawing occurs, the damage being left. This damage, ice crystals formed during freezing and dehydration considered to arise from contraction to, control of ice crystallization, amorphous in the state of a hardened, vitrification method, have been tried.
Vitrification is, frozen fertilized eggs and has been developed as a method, the conventional vitrification is, in general, by rapid freezing rate and a high solute concentration, an aqueous solution intended to be vitrified. For example, as a solution into the glass of the fertilized egg of the mouse, DAP213 is known. Is DAP213, DMSO 2M, 1M acetamide, a solution of propylene glycol and 3M, with a high concentration, high toxicity. A typical use method, a mouse fertilized egg contained in the water which, in this with solution, and then immersed in a liquid directly to the nitrogen, to obtain an glass state. However, such a vitrification solution is introduced into the glass, cells and high toxicity, damage caused by further recrystalization upon thawing is also high.
Therefore, the present inventors, considering the cryo-protectant material, to improve the method of the have attempted (patent document 1).
Is Patent Document 2, a large amount of sucrose is the polymer preparation.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
以下の(a)、(b)及び(c)からなる群から選択された、アミノ基及びカルボキシル基を同一分子中に有する両性高分子化合物と、
(d)エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子とを含む、動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤:
(a) ε-ポリ-L-リジンをブチル無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物;
(b) ε-ポリ-L-リジンを、ブチル無水コハク酸及び無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物; 又は
(c) ε-ポリ-L-リジンを、次の式I:
[化1]
(ただし、上記の式中、
R1及びR2は、それぞれ独立に、水素原子又はC1~C4のアルキル基であるか、あるいはR1及びR2が一体となって形成されたC1~C6のアルカン-ジイル基であり;
R3及びR4は、それぞれ独立に、水素原子又はC1~C4のアルキル基であるか、あるいはR3及びR4が一体となって形成されたC1~C6のアルカン-ジイル基であり;
R5及びR6は、それぞれ独立に、水素原子又はC1~C4のアルキル基であるか、あるいはR5及びR6が一体となって形成されたC1~C6のアルカン-ジイル基である)
で表される化合物と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物。
[請求項2]
式Iで表される化合物が、次の式II:
[化2]
(ただし、上記の式中、
R1及びR2は、それぞれ独立に、水素原子又はC1~C4のアルキル基であるか、あるいはR1及びR2が一体となって形成されたC1~C6のアルカン-ジイル基である)
で表される化合物である、請求項1に記載の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤。
[請求項3]
両性高分子化合物において、ε-ポリ-L-リジンの側鎖のアミノ基のうち、カルボキシル化されたアミノ基の割合が、50%~75%の範囲にある、請求項1又は請求項2に記載の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤。
[請求項4]
ε-ポリ-L-リジンを、ブチル無水コハク酸及び無水コハク酸と反応させてカルボキシル化した両性高分子化合物が、
ε-ポリ-L-リジンの側鎖のアミノ基のうち、無水コハク酸との反応によってカルボキシル化されたアミノ基の数Aに対する、
ε-ポリ-L-リジンの側鎖のアミノ基のうち、ブチル無水コハク酸との反応によってカルボキシル化されたアミノ基の数Bの比率B/Aが、
2/30~40/30の範囲にある、請求項1~3のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤。
[請求項5]
エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子の分子量が、10,000~1,000,000の範囲にある、請求項1~4のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤。
[請求項6]
請求項1~5のいずれかに記載された動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤を含有する生理溶液からなる、動物細胞凍結保存液。
[請求項7]
請求項1~5のいずれかに記載された動物細胞凍結保存液用ガラス化状態安定化剤を含有し、
エチレングリコール又はプロピレングリコールを、3~8Mの濃度で含有する、生理溶液からなる、動物細胞凍結保存液。
[請求項8]
さらに、スクロースを、0.1~1Mの濃度で含有する、請求項7に記載の動物細胞凍結保存液。
[請求項9]
(a)、(b)及び(c)からなる群から選択された両性高分子化合物を、2~40重量%で含有し、
エピクロロヒドリン架橋されたショ糖多量体高分子を、1~30重量%で含有する、請求項6~8のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液。
[請求項10]
動物細胞凍結保存液のガラス転移点が、-135℃~-80℃である、請求項6~9のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液。
[請求項11]
請求項6~10のいずれかに記載の動物細胞凍結保存液中へ、動物細胞を浸漬する工程、
動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、降温して凍結する工程、
を含む、動物細胞凍結保存方法。
[請求項12]
動物細胞を、降温して凍結する工程の後に、
凍結した、動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、昇温して解凍する工程、
を含む、請求項11に記載の動物細胞凍結保存方法。
[請求項13]
動物細胞を、降温して凍結する工程が、
動物細胞を、降温してガラス化状態で凍結する工程、である、請求項11~12のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
[請求項14]
動物細胞を、昇温して解凍する工程が、
動物細胞を、昇温して再結晶化することなく解凍する工程、である、請求項12~13のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
[請求項15]
降温して凍結する工程が、
降温速度5℃/分~50℃/分で降温して凍結する工程、である、請求項11~14のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
[請求項16]
昇温して解凍する工程が、
昇温速度5℃/分~100℃/分で昇温して解凍する工程、である、請求項12~15のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
[請求項17]
動物細胞を、降温して凍結する工程の後で、
凍結した、動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、昇温して解凍する工程の前に、
凍結した、動物細胞凍結保存液中の動物細胞を、-196℃~-75℃で保存する工程、
を含む、請求項12~16のいずれかに記載の動物細胞凍結保存方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • JAPAN ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
  • SHIBUYA CORPORATION
  • Inventor
  • MATSUMURA,Kazuaki
  • NAKA,Toshiaki
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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