Top > Search of International Patents > INDUCTION OF DIFFERENTIATION OF INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS INTO INTESTINAL EPITHELIAL CELLS

INDUCTION OF DIFFERENTIATION OF INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS INTO INTESTINAL EPITHELIAL CELLS

Foreign code F170009236
File No. (S2016-0443-N0)
Posted date Sep 21, 2017
Country WIPO
International application number 2017JP008616
International publication number WO 2017154795
Date of international filing Mar 3, 2017
Date of international publication Sep 14, 2017
Priority data
  • P2016-044088 (Mar 8, 2016) JP
Title INDUCTION OF DIFFERENTIATION OF INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS INTO INTESTINAL EPITHELIAL CELLS
Abstract This invention addresses the problem of providing: a novel method that allows, in a simple manner, preparation of cells that exhibit a function similar to that of intestinal epithelial cells of a living body; and an application therefor. Induced pluripotent stem cells are induced to differentiate into intestinal epithelial cells by: (1) a step for differentiating the induced pluripotent stem cells into endoderm-like cells; (2) a step for differentiating the endoderm-like cells obtained in step (1) into intestinal stem cell-like cells; and (3) a step for differentiating the intestinal stem cell-like cells obtained in step (2) into intestinal epithelial cell-like cells, the step including culturing in the presence of an MEK1 inhibitor, a DNA methylation inhibitor, a TGFβ receptor inhibitor, and EGF, and in a condition in which cAMP is fed to the cells.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
A number of the small intestine the drug-metabolizing enzyme or drug transporter because of the presence, in the same manner as the liver, as an organ relating to the first-pass effect of the drug which is very important. Therefore, early stages of drug development from the membrane permeability of the medicament in the small intestine to evaluate and metabolism, the development of pharmaceutical products having excellent pharmacokinetic properties required. The present invention is, to cure the photo-curable resin material of the three-dimensional object by a molding technique. However, drug transporter Caco-2 cells different from the expression pattern of human small intestine. In addition, the drug-metabolizing enzyme cells Caco-2 expression and enzyme induction almost not found, accurately to assess the pharmacokinetics of the small intestine is difficult. Therefore, membrane permeability and drug metabolism in the small intestine of an overall evaluation was made for the use of primary small intestine epithelial cells is desirable, it is difficult to obtain primary small intestine epithelial cells.
However, human induced pluripotent stem (induced pluripotent stem: iPS) cells are established by yamanaka et al. in the year 2007. The human iPS cells, established by Thomson et al. in the year 1998 human embryonic stem cells (embryonic stem: ES) similar to, pluripotency and proliferative potential in cells with an almost limitless. Human ES cells may be of human iPS ethical fewer problems as compared with the cell, stable cell for drug development is expected as a source.
In addition, the absorption of the drugs used as a test to provide the intestinal epithelial cells, intestinal stem/progenitor cells from a cell derived from the intestinal tract to rapidly acquire selectively have been reported (patent document 1). In addition, an inhibitor of ALK5 produced using a method not maintain pluripotent cells has been proposed (patent document 2).
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
以下の工程(1)~(3)を含む、人工多能性幹細胞を腸管上皮細胞へ分化誘導する方法:
(1)人工多能性幹細胞を内胚葉様細胞へと分化させる工程;
(2)工程(1)で得られた内胚葉様細胞を腸管幹細胞様細胞へと分化させる工程;
(3)工程(2)で得られた腸管幹細胞様細胞を腸管上皮細胞様細胞へと分化させる工程であって、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を含む工程。
[請求項2]
工程(3)の前記培養の期間が7日間~40日間である、請求項1に記載の方法。
[請求項3]
工程(3)が、以下のA~Cのいずれかの培養工程を含む、請求項1に記載の方法、
培養工程A:(a-1)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養と、該培養に続く、(a-2)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を含む、
培養工程B:(b-1)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養と、該培養に続く、(b-2)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤、EGF及びcAMP分解酵素阻害剤の存在下での培養を含む、
培養工程C:(c-1)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下、且つcAMPが細胞へ供給される条件下での培養を含む。
[請求項4]
(a-1)の培養の期間は1日間~5日間であり、(a-2)の培養の期間は3日間~15日間であり、
(b-1)の培養の期間は3日間~15日間であり、(b-2)の培養の期間は3日間~15日間であり、
(c-1)の培養の期間は3日間~15日間である、請求項3に記載の方法。
[請求項5]
(a-2)の培養、(b-1)の培養、及び(c-1)の培養が、MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFに加えてcAMP分解酵素阻害剤も存在する条件で行われる、請求項3又は4に記載の方法。
[請求項6]
培養工程Aが、(a-2)の培養に続く、(a-3)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養を含み、
培養工程Bが、(b-2)の培養に続く、(b-3)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養を含み、
培養工程Cが、(c-1)の培養に続く、(c-2)MEK1阻害剤、DNAメチル化阻害剤、TGFβ受容体阻害剤及びEGFの存在下での培養を含む、請求項2~5のいずれか一項に記載の方法。
[請求項7]
(a-3)の培養、(b-3)の培養、及び(c-2)の培養の期間は1日間~10日間である、請求項6に記載の方法。
[請求項8]
cAMPが細胞へ供給される条件が、培地中に8-Br-cAMPが存在することである、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
[請求項9]
cAMP分解酵素阻害剤がIBMXである、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
[請求項10]
MEK1阻害剤がPD98059であり、DNAメチル化阻害剤が5-アザ-2’-デオキシシチジンであり、TGFβ受容体阻害剤がA-83-01である、請求項1~9のいずれか一項に記載の方法。
[請求項11]
工程(1)における分化誘導因子としてアクチビンAを用いる、請求項1~10のいずれか一項に記載の方法。
[請求項12]
工程(2)における分化誘導因子としてFGF2を用いる、請求項1~11のいずれか一項に記載の方法。
[請求項13]
人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項1~12のいずれか一項に記載の方法。
[請求項14]
請求項1~13のいずれか一項に記載の方法で得られた腸管上皮細胞様細胞。
[請求項15]
請求項14に記載の腸管上皮細胞様細胞を用いた、被検物質の体内動態又は毒性を評価する方法。
[請求項16]
前記体内動態が、代謝、吸収、排泄、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導である、請求項15に記載の方法。
[請求項17]
以下の工程(i)~(iii)を含む、請求項15又は16に記載の方法:
(i)請求項14に記載の腸管上皮細胞様細胞で構成された細胞層を用意する工程;
(ii)前記細胞層に被検物質を接触させる工程;
(iii)前記細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を評価する工程。
[請求項18]
以下の工程(I)及び(II)を含む、請求項15又は16に記載の方法:
(I)請求項14に記載の腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程;
(II)被検物質の代謝若しくは吸収、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を測定・評価する工程。
[請求項19]
以下の工程(a)及び(b)を含む、被検物質の消化管粘膜障害作用を評価する方法:
(a)請求項14に記載の腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程;
(b)前記腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の消化管粘膜障害作用を判定する工程であって、ムチン2の発現低下が認められることが、被検物質が消化管粘膜障害作用を有することの指標となる工程。
[請求項20]
以下の工程(A)及び(B)を含む、被検物質の消化管粘膜保護作用を評価する方法:
(A)請求項14に記載の腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程;
(B)前記腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2の発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の消化管粘膜保護作用を判定する工程であって、前記物質によるムチン2の発現上昇が認められることが、被検物質が消化管粘膜保護作用を有することの指標となる工程。
[請求項21]
請求項14に記載の腸管上皮細胞様細胞を含む、細胞製剤。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • NAGOYA CITY UNIVERSITY
  • Inventor
  • IWAO Takahiro
  • KABEYA Tomoki
  • MATSUNAGA Tamihide
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
Please contact us by E-mail or facsimile if you have any interests on this patent.

PAGE TOP

close
close
close
close
close
close