Top > Search of International Patents > METHOD FOR AMPLIFYING CYCLIC DNA

METHOD FOR AMPLIFYING CYCLIC DNA meetings

Foreign code F170009298
File No. IP14P002
Posted date Dec 7, 2017
Country WIPO
International application number 2017JP018472
International publication number WO 2017199991
Date of international filing May 17, 2017
Date of international publication Nov 23, 2017
Priority data
  • P2016-099157 (May 17, 2016) JP
Title METHOD FOR AMPLIFYING CYCLIC DNA meetings
Abstract Provided is a method for amplifying cyclic DNA, particularly long-chain cyclic DNA, simply and exponentially in a cell-free system. More specifically, a cyclic DNA amplification method is provided, which comprises allowing to react a reaction mixture produced by mixing cyclic DNA having an origin sequence of chromosomal replication (an origin of chromosome (oriC)) with a reaction solution, wherein the reaction solution contains enzymes (1) to (3) as mentioned below, a buffer solution, NTP, dNTP, a magnesium ion source and an alkali metal ion source: (1) a first group enzyme which can catalyze the replication of cyclic DNA; (2) a second group enzyme which can catalyze an Okazaki fragment connection reaction to synthesize two sister cyclic DNA molecules capable of forming a catenane; and (3) a third group enzyme which can catalyze a reaction of separating two sister cyclic DNA molecules from each other.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Development of biotechnology is DNA cloning techniques are based, DNA fragments were prepared by the paste within the cells such as E. coli DNA plasmid annular as a method of amplifying. DNA cloning techniques were used to amplify the DNA in the case of annular, cell culture and the extraction of the amplification product, such as purified and a complicated procedure is required. In addition, cells were used for cloning the gene DNA is necessary to produce a recombinant organism, to limitations in the experimental environment.
In vitro DNA amplification methods include, polymerase chain reaction (PCR) is generally used. However, the test tube by PCR DNA amplification method, the DNA is amplified as it is not annular. In vitro DNA amplification methods include an annular, rolling circle amplification (RCA) method and the like (Non-Patent Document 1, Patent Document 1, Patent Document 2, Patent Document 3). However, the rolling-circle amplification method for amplifying DNA is annular, every target DNA with primers specific for the design. In addition, direct rolling circle DNA amplification products is straight-chain, the amplification products obtained in order to make an annular shape, such as recombinant enzyme incubated with an annular step is further required. E. coli chromosome replication (oriC cyclic DNA) mini and then, this was separated, the single amount of the annular body to obtain the replication products have been reported (Non-Patent Document 2-5). However, these documents used in the reaction conditions, as the DNA molecule is a cyclic copy of the efficiency, of the template DNA were added to about 15-40% and remains, as does not reach twice the amplification amount can be shown experimentally (Non-Patent Document 3-6). Further, in these documents is used as the template 10 kbp remains less than the size of the circular DNA.
In this way, the in vitro DNA amplification method in the prior art for amplifying DNA is annular, the binding of the primer DNA template is necessary, and DNA amplification products is straight-chain, in addition, the number of amplifiable DNA was kbp size remains. Further, the mini chromosome replication system is used in the E. coli cyclic attempts to generate an amplification product in the case, an annular template DNA is not amplified even times a problem.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
環状DNAの増幅方法であって、以下の工程:
(1)鋳型となる環状DNAと、以下:
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群;
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群;
2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群;
緩衝液;
ATP;
GTP、CTPおよびUTP;
dNTP;
マグネシウムイオン源;および
アルカリ金属イオン源;
を含む反応液との反応混合物を形成する工程、
ここで当該環状DNAはDnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列(origin of chromosome(oriC))を含む;および
(2)工程(1)において形成した反応混合物を等温条件下で保温する工程;
を含む、前記方法。
[請求項2]
環状DNAの増幅方法であって、以下の工程:
(1)鋳型となる環状DNAと、以下:
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群;
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群;
2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群;
緩衝液;
ATP;
GTP、CTPおよびUTP;
dNTP;
マグネシウムイオン源;および
アルカリ金属イオン源;
を含む反応液との反応混合物を形成する工程、
ここで当該環状DNAはDnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列(origin of chromosome(oriC))を含む;および
(2)工程(1)において形成した反応混合物を、30℃以上でのインキュベーションおよび27℃以下でのインキュベーションを繰り返す温度サイクル下で、インキュベートする工程;
を含む、前記方法。
[請求項3]
反応液が、さらにタンパク質の非特異吸着抑制剤、および/または核酸の非特異吸着抑制剤を含む、請求項1または2に記載の方法。
[請求項4]
反応液が、さらに直鎖状DNA特異的エキソヌクレアーゼおよび/またはRecG型ヘリカーゼを含む、請求項1または2に記載の方法。
[請求項5]
反応液が、さらにアンモニウム塩を含む、請求項1または2に記載の方法。
[請求項6]
第一の酵素群が、DnaA活性を有する酵素、1種以上の核様体タンパク質、DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群、一本鎖DNA結合タンパク質(single-strand binding protein(SSB))、DnaB型ヘリカーゼ活性を有する酵素、DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素、DNAプライマーゼ活性を有する酵素、DNAクランプ活性を有する酵素、およびDNAポリメラーゼIII*活性を有する酵素または酵素群、の組み合わせを含み、
第二の酵素群が、DNAポリメラーゼI活性を有する酵素およびDNAリガーゼ活性を有する酵素の組み合わせを含み、
第三の酵素群が、トポイソメラーゼIII活性を有する酵素および/またはトポイソメラーゼIV活性を有する酵素を含む、
請求項1または2に記載の方法。
[請求項7]
第二の酵素群がさらに、RNaseH活性を有する酵素を含む、請求項6に記載の方法。
[請求項8]
第三の酵素群がさらに、RecQ型ヘリカーゼ活性を有する酵素を含む、請求項6に記載の方法。
[請求項9]
第一の酵素群において、
1種以上の核様体タンパク質がIHFまたはHUであり、
DNAジャイレース活性を有する酵素または酵素群が、GyrAおよびGyrBからなる複合体であり、
DnaB型ヘリカーゼ活性を有する酵素がDnaBヘリカーゼであり、
DNAヘリカーゼローダー活性を有する酵素がDnaCヘリカーゼローダーであり、
DNAプライマーゼ活性を有する酵素がDnaGプライマーゼであり、
DNAクランプ活性を有する酵素がDnaNクランプであり、
DNAポリメラーゼIII*活性を有する酵素または酵素群が、DnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ、およびHolEのいずれかを含む酵素または酵素群である、
請求項6に記載の方法。
[請求項10]
工程(2)における等温条件が、25℃~50℃の範囲に含まれる一定の温度である、請求項1に記載の方法。
[請求項11]
反応液が、さらにRecG型ヘリカーゼおよび/または一本鎖DNA特異的エキソヌクレアーゼを含む、請求項1または2に記載の方法。
[請求項12]
反応液が、さらに直鎖状DNA特異的エキソヌクレアーゼおよび/または一本鎖DNA特異的エキソヌクレアーゼを含む、請求項1または2に記載の方法。
[請求項13]
反応液が、さらにDNAの安定化因子を含む、請求項1または2に記載の方法。
[請求項14]
工程(1)が
(1-1)以下:
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群;
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群;
2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群;
緩衝液;
ATP;
GTP、CTPおよびUTP;
dNTP;
マグネシウムイオン源;および
アルカリ金属イオン源;
を含む反応液をプレインキュベーションする工程;
(1-2)当該反応液と鋳型となる環状DNAとの反応混合物を形成する工程;および
を含む、請求項1または2に記載の方法。
[請求項15]
工程(2)を、油中水滴型エマルジョン内で行う、請求項1または2に記載の方法。
[請求項16]
工程(2)に続いてさらに、
(3)反応後処理を行う工程;を含み、ここで、当該反応後処理は、
(i)第一から第三の酵素群を含まない反応液で五倍以上に希釈した後、再保温する処理;
(ii)直鎖状DNA特異的エキソヌクレアーゼおよび/または一本鎖DNA特異的エキソヌクレアーゼによる処理;および/または
(iii)ギャップリペア酵素による処理;である、
請求項1または2に記載の方法。
[請求項17]
環状DNAの増幅用組成物であって、
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群;
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群;
2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群;
緩衝液;
ATP;
GTP、CTPおよびUTP;
dNTP;
マグネシウムイオン源;および
アルカリ金属イオン源;
を含む、前記組成物。
[請求項18]
さらにタンパク質の非特異吸着抑制剤、および/または核酸の非特異吸着抑制剤を含む、請求項17に記載の組成物。
[請求項19]
さらに直鎖状DNA特異的エキソヌクレアーゼおよび/またはRecG型ヘリカーゼを含む、請求項17に記載の組成物。
[請求項20]
さらにRecG型ヘリカーゼおよび/または一本鎖DNA特異的エキソヌクレアーゼを含む、請求項17に記載の組成物。
[請求項21]
さらに直鎖状DNA特異的エキソヌクレアーゼおよび/または一本鎖DNA特異的エキソヌクレアーゼを含む、請求項17に記載の組成物。
[請求項22]
さらにDNAの安定化因子を含む、請求項17に記載の組成物。
[請求項23]
環状DNAの増幅用キットであって、
環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群;
岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群;
2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群;
緩衝液;
ATP;
GTP、CTPおよびUTP;
dNTP;
マグネシウムイオン源;および
アルカリ金属イオン源;
の組み合わせを含む、前記キット。
[請求項24]
さらにタンパク質の非特異吸着抑制剤、および/または核酸の非特異吸着抑制剤との組み合わせを含む、請求項23に記載のキット。
[請求項25]
さらに直鎖状DNA特異的エキソヌクレアーゼおよび/またはRecG型ヘリカーゼとの組み合わせを含む、請求項23に記載のキット。
[請求項26]
さらにRecG型ヘリカーゼおよび/または一本鎖DNA特異的エキソヌクレアーゼを含む、請求項23に記載のキット。
[請求項27]
さらに直鎖状DNA特異的エキソヌクレアーゼおよび/または一本鎖DNA特異的エキソヌクレアーゼを含む、請求項23に記載のキット。
[請求項28]
さらにDNAの安定化因子を含む、請求項23に記載のキット。
[請求項29]
さらにギャップリペア酵素を含む、請求項23に記載のキット。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY
  • Inventor
  • SU'ETSUGU, Masayuki
  • TSUJIMOTO, Hiroko
  • SHINOHARA, Takeshi
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
Please contact us by E-mail or facsimile if you have any interests on this patent.

PAGE TOP

close
close
close
close
close
close