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METHOD AND SYSTEM FOR ANALYZING N-LINKED SUGAR CHAINS OF GLYCOPROTEIN

Foreign code F180009395
File No. (S2016-1050-N0)
Posted date Apr 20, 2018
Country WIPO
International application number 2017JP029658
International publication number WO 2018034346
Date of international filing Aug 18, 2017
Date of international publication Feb 22, 2018
Priority data
  • P2016-161118 (Aug 19, 2016) JP
Title METHOD AND SYSTEM FOR ANALYZING N-LINKED SUGAR CHAINS OF GLYCOPROTEIN
Abstract Disclosed is a novel means for accurately performing qualitative and quantitative analysis of each of the linkage sites of N-linked sugar chains. In a method for analyzing N-linked sugar chains of glycoprotein according to the present invention, a portion of a glycopeptide-containing sample to be analyzed is treated with endo-β-N-acetylglucosaminidase, sugar chains are cleaved to leave only a single GlcNAc of a chitobiose core on an Asn linked to N-linked sugar chains, the sugar chain-cleaved sample is pre-analyzed using liquid chromatography/mass spectrometry, and the liquid chromatography retention time of the target glycopeptide to be analyzed and m/z of precursor ions are predicted on the basis of the results of the pre-analysis to perform a main analysis. Thereby, the linkage sites and structures of N-linked sugar chains linked to the glycoprotein can be analyzed. By using the sugar chain-cleaved sample as an internal standard in the main analysis, each of the sugar chain linkage sites of sugar chains can also be quantitatively analyzed.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Sugar chain is an important posttranslational modifications of proteins and, in recent years, analysis of their structure and function has been promoted rapidly. Such glycoproteins, glycopeptides as a method of analyzing, liquid chromatography/mass spectrometry method using the adapted to be widely used. Liquid chromatography/mass spectrometry such as N-linked glycoproteins used, when analyzing the structure of a peptide, a sugar chain of the peptide were deglycosylated -N- (PNGase F) by the cutting is performed, N-linked sugar chain bound to asparagine (Asn) aspartic acid (Asp) is changed to, by detecting the change in N-linked sugar chains generally the method of determining the position. (For example Patent Document 1, Non-Patent Document 1 reference).
However, N-linked sugar chain binding using PNGase F is located at a position to observe the change of the Asn Asp to a method, according to the Asp Asn deamidation or a change, due to the variation of the Asp PNGase F processing cannot determine whether the problem, the change in mass of from +1 Da to Asn Asp small as, erroneous identification of one problem tends to frequently 2.
As a measure for these problems, for example, stable isotope labeled H218 Oin the PNGase F sugar chain can be cut, sugar chain binding position of the Asn to Asp to change when the hydroxy groups of the carboxyl groups of Asp18 Olabeled with, +3 Da the weight change can be differentiated and deamidation of Asn, mono isotopic peak picking of the method for mitigating the identified error due to the used (for example see Non-Patent Document 1).
Glycoproteins, glycopeptides released from of the sugar chain is in relation to, N-linked sugar chains PNGase F all of the free and disconnected from a protein, sugar chain is labeled with a liquid chromatography and the like may be measured using a known method (for example see Patent Document 2).
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
N結合型糖鎖を有する糖タンパク質を断片化して糖ペプチド含有試料を得る、糖タンパク質断片化工程、
糖ペプチド含有試料の一部をエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼと反応させ、糖鎖とアスパラギン(Asn)残基との結合部に存在するキトビオースのβ-1,4結合を切断することにより、1残基のN-アセチルグルコサミン(GlcNAc)(ただし該GlcNAcには1残基のフコース(Fuc)が結合していてもよい)をペプチド上に残して糖鎖を切断する、糖鎖切断工程、
糖鎖切断工程で得られた糖鎖切断ペプチド試料に対して液体クロマトグラフィー/質量分析を行ない、クロマトグラム、マススペクトル及びプロダクトイオンスペクトルを得る、事前液体クロマトグラフィー/質量分析工程、
Asn残基のGlcNAc修飾又はGlcNAc-Fuc修飾を考慮したMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析を行ない、糖ペプチドにおける糖鎖結合位置を決定する、糖鎖結合位置決定工程、
事前液体クロマトグラフィー/質量分析及びMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析の結果より、糖鎖切断前の糖ペプチドの液体クロマトグラフィー保持時間及びプリカーサーイオンのm/zを推定する、保持時間・m/z推定工程、
糖ペプチド含有試料の残部を液体クロマトグラフィー/質量分析に供し、前記保持時間及び前記m/zの推定結果に従い分析すべきプリカーサーイオンピークを選定し、選定されたピークに対してプリカーサーイオン選択質量分析を行ない、糖ペプチドの糖鎖構造を決定する、本分析工程、
を含む、糖タンパク質のN結合型糖鎖の解析方法。
[請求項2]
エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼが、Endo F1、Endo F2、Endo F3、Endo M、Endo H及びEndo Sから選択される1種又は2種以上を含む、請求項1記載の方法。
[請求項3]
糖ペプチド含有試料として、糖鎖が結合していないペプチドを除去して糖ペプチドを濃縮した試料を用いる、請求項1又は2記載の方法。
[請求項4]
糖鎖切断工程で得られた糖鎖切断ペプチド試料を内部標準として、糖ペプチド含有試料の残部に添加して本分析工程を実施し、当該糖鎖結合部位に存在する糖鎖を相対定量することをさらに含む、請求項1~3のいずれか1項に記載の方法。
[請求項5]
前記内部標準として、糖鎖未切断の糖ペプチドを除去した糖鎖切断ペプチド試料を用いる、請求項4記載の方法。
[請求項6]
糖鎖未切断の糖ペプチドの除去は、冷却したアセトンを添加し、糖鎖未切断の糖ペプチドを沈殿させて分離する方法により、又は親水性相互作用クロマトグラフィーを用いて糖鎖未切断の糖ペプチドを吸着除去することにより行われる、請求項5記載の方法。
[請求項7]
N結合型糖鎖を有する糖タンパク質を断片化した糖ペプチド含有試料より調製された、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼにより1残基のGlcNAc(ただし該GlcNAcには1残基のFucが結合していてもよい)をペプチド中のAsn残基上に残して糖鎖が切断された糖鎖切断ペプチド試料について、クロマトグラム、マススペクトル及びプロダクトイオンスペクトルを取得する、事前液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部と、
Asn残基のGlcNAc修飾又はGlcNAc-Fuc修飾を考慮したMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析を行ない、糖ペプチドにおける糖鎖結合位置を決定する、糖鎖結合位置決定部と、
事前液体クロマトグラフィー/質量分析及びMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析の結果より、糖鎖切断前の糖ペプチドの液体クロマトグラフィー保持時間及びプリカーサーイオンのm/zを推定する、保持時間・m/z推定部と、
本分析用試料である糖鎖切断前の糖ペプチド含有試料について、本分析を行なう、本分析部であって、
本分析用試料について、クロマトグラム、及び推定された保持時間の画分のマススペクトルを取得する、本分析用試料の液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
m/zの推定結果に従い、前記推定された保持時間の画分のマススペクトルより分析すべきプリカーサーイオンピークを選定する、分析対象ピーク選定部、及び
選定された分析対象ピークについてのプリカーサーイオン選択質量分析データを取得し、糖ペプチドの糖鎖構造を決定する、糖鎖構造決定部
を含む、本分析部と、
分析結果を出力する出力部と
を備える、糖タンパク質のN結合型糖鎖の解析システム。
[請求項8]
N結合型糖鎖を有する糖タンパク質を断片化した糖ペプチド含有試料より調製された、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼにより1残基のGlcNAc(ただし該GlcNAcには1残基のFucが結合していてもよい)をペプチド中のAsn残基上に残して糖鎖が切断された糖鎖切断ペプチド試料について、クロマトグラム、マススペクトル及びプロダクトイオンスペクトルを取得する、事前液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部と、
Asn残基のGlcNAc修飾又はGlcNAc-Fuc修飾を考慮したMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析を行ない、糖ペプチドにおける糖鎖結合位置を決定する、糖鎖結合位置決定部と、
事前液体クロマトグラフィー/質量分析及びMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析の結果より、糖鎖切断前の糖ペプチドの液体クロマトグラフィー保持時間及びプリカーサーイオンのm/zを推定する、保持時間・m/z推定部と、
本分析用試料である糖鎖切断前の糖ペプチド含有試料について、本分析を行なう、本分析部であって、
前記糖鎖切断ペプチド試料が内部標準として添加された本分析用試料について、クロマトグラム、及び推定された保持時間の画分のマススペクトルを取得する、本分析用試料の液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
m/zの推定結果に従い、前記推定された保持時間の画分のマススペクトルより分析すべきプリカーサーイオンピークを選定する、分析対象ピーク選定部、
選定された分析対象ピークについてのプリカーサーイオン選択質量分析データを取得し、糖ペプチドの糖鎖構造を決定する、糖鎖構造決定部、及び
内部標準と各糖ペプチドの抽出イオンクロマトグラムを取得して、内部標準に対する各糖ペプチドの相対強度を算出することにより、当該糖鎖結合部位に存在する糖鎖を相対定量する、糖鎖定量部
を含む、本分析部と、
分析結果を出力する出力部と
を備える、糖タンパク質のN結合型糖鎖の解析システム。
[請求項9]
糖タンパク質のN結合型糖鎖を解析するために、1又は複数のコンピューターを、
N結合型糖鎖を有する糖タンパク質を断片化した糖ペプチド含有試料より調製された、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼにより1残基のGlcNAc(ただし該GlcNAcには1残基のFucが結合していてもよい)をペプチド中のAsn残基上に残して糖鎖が切断された糖鎖切断ペプチド試料について、クロマトグラム、マススペクトル及びプロダクトイオンスペクトルを取得する、事前液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
Asn残基のGlcNAc修飾又はGlcNAc-Fuc修飾を考慮したMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析を行ない、糖ペプチドにおける糖鎖結合位置を決定する、糖鎖結合位置決定部、
事前液体クロマトグラフィー/質量分析及びMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析の結果より、糖鎖切断前の糖ペプチドの液体クロマトグラフィー保持時間及びプリカーサーイオンのm/zを推定する、保持時間・m/z推定部、
本分析用試料である、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼによる糖鎖切断処理を受けていない糖ペプチド含有試料について、本分析を行なう、本分析部であって、
本分析用試料について、クロマトグラム、及び推定された保持時間の画分のマススペクトルを取得する、本分析用試料の液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
m/zの推定結果に従い、前記推定された保持時間の画分のマススペクトルより分析すべきプリカーサーイオンピークを選定する、分析対象ピーク選定部、及び
選定された分析対象ピークについてのプリカーサーイオン選択質量分析データを取得し、糖ペプチドの糖鎖構造を決定する、糖鎖構造決定部
を含む、本分析部、並びに
分析結果を出力する出力部
として機能させるためのプログラム。
[請求項10]
糖タンパク質のN結合型糖鎖を解析するために、1又は複数のコンピューターを、
N結合型糖鎖を有する糖タンパク質を断片化した糖ペプチド含有試料より調製された、エンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼにより1残基のGlcNAc(ただし該GlcNAcには1残基のFucが結合していてもよい)をペプチド中のAsn残基上に残して糖鎖が切断された糖鎖切断ペプチド試料について、クロマトグラム、マススペクトル及びプロダクトイオンスペクトルを取得する、事前液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
Asn残基のGlcNAc修飾又はGlcNAc-Fuc修飾を考慮したMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析を行ない、糖ペプチドにおける糖鎖結合位置を決定する、糖鎖結合位置決定部、
事前液体クロマトグラフィー/質量分析及びMS/MSイオンサーチ又はde novoシーケンス解析の結果より、糖鎖切断前の糖ペプチドの液体クロマトグラフィー保持時間及びプリカーサーイオンのm/zを推定する、保持時間・m/z推定部、
本分析用試料である糖鎖切断前の糖ペプチド含有試料について、本分析を行なう、本分析部であって、
前記糖鎖切断ペプチド試料が内部標準として添加された本分析用試料について、クロマトグラム、及び推定された保持時間の画分のマススペクトルを取得する、本分析用試料の液体クロマトグラフィー/質量分析データ取得部、
m/zの推定結果に従い、前記推定された保持時間の画分のマススペクトルより分析すべきプリカーサーイオンピークを選定する、分析対象ピーク選定部、
選定された分析対象ピークについてのプリカーサーイオン選択質量分析データを取得し、糖ペプチドの糖鎖構造を決定する、糖鎖構造決定部、及び
内部標準と各糖ペプチドの抽出イオンクロマトグラムを取得して、内部標準に対する各糖ペプチドの相対強度を算出することにより、当該糖鎖結合部位に存在する糖鎖を相対定量する、糖鎖定量部
を含む、本分析部、並びに
分析結果を出力する出力部
として機能させるためのプログラム。
[請求項11]
EEQYNSTYR、EEQFNSTFR、EEQYNSTFR、又はEEQFNSTYRのアミノ酸配列からなるペプチドのアスパラギン残基に、1残基のGlcNAc、又は1残基のFucが結合した1残基のGlcNAcが結合してなる、IgG型抗体のトリプシン消化物に含まれる糖ペプチドを定量解析するための内部標準ペプチド。
[請求項12]
IgG型抗体を断片化したペプチド混合物から糖ペプチドを分離回収し、糖ペプチドをエンド-β-N-アセチルグルコサミニダーゼと反応させた後、糖鎖未切断の糖ペプチドを除去することを含む、IgG型抗体の糖鎖を定量解析するための内部標準の製造方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • YOKOHAMA CITY UNIVERSITY
  • Inventor
  • OHTA, Yuki
  • KAWASAKI, Nana
  • TAKAKURA, Daisuke
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JO JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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