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METHOD AND KIT FOR DETECTING PATHOGENIC MICROORGANISM

Foreign code F180009402
File No. (AF19P018)
Posted date Apr 20, 2018
Country WIPO
International application number 2017JP031689
International publication number WO 2018043733
Date of international filing Sep 4, 2017
Date of international publication Mar 8, 2018
Priority data
  • P2016-172515 (Sep 5, 2016) JP
  • P2017-099579 (May 19, 2017) JP
Title METHOD AND KIT FOR DETECTING PATHOGENIC MICROORGANISM
Abstract Provided is a method for detecting pathogenic microorganisms in a biological sample, which is a technique that can be used to perform high-sensitivity detection of pathogenic microorganisms, such as influenza virus, etc., the method including: an introducing step for introducing a hydrophilic solvent that contains the biological sample and substances that serve as substrates for reactions involving enzymes that are present on surfaces of the pathogenic microorganisms or in the interiors thereof into a space between a lower-layer section in which a plurality of accommodating sections that can accommodate the pathogenic microorganisms are formed and an upper-layer section that faces a surface in which the accommodating sections are formed in the lower-layer section; an encapsulating step for introducing a hydrophobic solvent into the space and forming, in the accommodating sections, droplets of the hydrophilic solvent that are coated by the hydrophobic solvent enveloping the pathogenic microorganisms and the substances; and a detecting step for optically detecting reaction products that are generated as a result of the reactions between the enzymes and the substances in the droplets, wherein the hydrophilic solvent has a pH value that is greater than the acid dissociation constant (pKa) of the reaction products.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
In recent years, simple immunoaffinity chromatography using a test kit is influenza virus has been developed (see Patent Document 1). The method of using immunoaffinity chromatography, from a few minutes to several tens of minutes the influenza virus can be detected, such as diagnosis and treatment of infections are utilized.
In addition, the prior art, the influenza virus and neuraminidase is an enzyme chromogenic substrate and optically based on the reaction of the detection of an influenza virus has been known a technique (Patent Document 2, reference 3). Colored substrates include, for example, 4-- α-D - methylumbellerferyl (4-Methylumbelliferyl-N-acetyl- α-D-neuraminic acid neuramatic acid: 4MU-NANA, see Patent Document 2) or, 4-or 4,7 - alkoxy -N- - N - dialkoxy-acetylneuraminic acid (see Patent Document 3) and derivatives thereof-acetylneuraminic acid and the like is used. For example, as a method using a chromogenic substrate is 4MU-NANA, neuraminidase by the decomposition of the fluorescent substance by 4MU-NANA 4-methylumbelliferone is generated. The generated 4-based on the amount of enzymatic activity of the neuraminidase methylumbelliferone value can be calculated, based on the enzymatic activity of the influenza virus further particle number can be quantified.
Associated with the present invention, the non-patent document 1, and covered with the oil droplets, the droplets from the outside of the femtoliter order accessible using the array of droplets, a method of an enzyme molecule has been described.
Scope of claims (In Japanese)[請求項1]
病原性微生物に感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料中の前記病原性微生物を検出する方法であって、
前記病原性微生物を収容可能な複数の収容部が、疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、当該下層部における当該収容部が形成されている面に対向している上層部との間の空間に、前記生物試料と、前記病原性微生物の表面又は内部に存在する酵素による反応の基質となる物質と、を含む親水性溶媒を導入する導入手順と、
前記空間に疎水性溶媒を導入して、前記収容部内に、疎水性溶媒で被覆されかつ前記病原性微生物と前記物質を包含する、親水性溶媒の液滴を形成する封入手順と、
前記液滴中における前記酵素と前記物質との反応により生成する反応生成物を光学的に検出する検出手順と、を含み、
前記親水性溶媒が、前記反応生成物の酸解離定数(pKa)よりも大きいpH値を有する、方法。

[請求項2]
前記病原性微生物がインフルエンザウイルスであり、前記酵素がノイラミニダーゼであり、前記物質が4-メチルウンベリフェリル-α-D-ノイラミン酸(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid)であり、前記反応生成物が4-メチルウンベリフェロンである、請求項1記載の方法。

[請求項3]
病原性微生物に感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料中の前記病原性微生物を検出するためのキットであって、
前記病原性微生物を収容可能な複数の収容部が疎水性の上面を有する側壁によって互いに隔てられて形成されている下層部と、前記下層部における前記収容部が形成されている面に対して空間を隔てて対向している上層部とを備えるアレイと、
前記病原性微生物の表面又は内部に存在する酵素による反応の基質となる物質と、
前記酵素と前記物質との反応により生成する反応生成物の酸解離定数(pKa)よりも大きいpH値を有する親水性溶媒と、
疎水性溶媒と、を含むキット。

[請求項4]
疎水性溶媒と界面接触する親水性溶媒中において、酵素と、該酵素による反応の基質となる物質とを反応させ、反応生成物を検出する方法であって、
前記親水性溶媒が、前記反応生成物の酸解離定数(pKa)よりも大きいpH値を有する、方法。

[請求項5]
前記親水性溶媒が病原性微生物を含み、
前記酵素が前記病原性微生物の表面又は内部に存在する基質切断活性を有する酵素であり、
前記物質が発色基質であり、
前記酵素による前記発色基質の切断により生成する反応生成物を光学的に検出する、請求項4記載の方法。

[請求項6]
前記病原性微生物がインフルエンザウイルスであり、前記酵素がノイラミニダーゼであり、前記発色基質が4-メチルウンベリフェリル-α-D-ノイラミン酸(4-Methylumbelliferyl-N-acetyl-α-D-neuraminic acid)であり、前記反応生成物が4-メチルウンベリフェロンである、請求項5記載の方法。

[請求項7]
前記親水性溶媒が、前記病原性微生物に感染した対象又は感染した疑いがある対象から分離された生物試料を含む、請求項5又は6記載の方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY
  • Inventor
  • NOJI Hiroyuki
  • TABATA Kazuhito
IPC(International Patent Classification)
Reference ( R and D project ) CREST Creation of Nanosystems with Novel Functions through Process Integration AREA
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