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METHOD FOR PRODUCING MESENCHYMAL STEM CELLS, THERAPEUTIC EFFECT MARKER OF MESENCHYMAL STEM CELLS, METHOD FOR DETERMINING THERAPEUTIC EFFECTS OF MESENCHYMAL STEM CELLS, AND CELLULAR PREPARATION CONTAINING MESENCHYMAL STEM CELLS meetings

Foreign code F180009486
File No. 16008-WO01
Posted date Oct 12, 2018
Country WIPO
International application number 2018JP016883
International publication number WO 2018199194
Date of international filing Apr 25, 2018
Date of international publication Nov 1, 2018
Priority data
  • P2017-086514 (Apr 25, 2017) JP
  • P2017-092030 (May 3, 2017) JP
Title METHOD FOR PRODUCING MESENCHYMAL STEM CELLS, THERAPEUTIC EFFECT MARKER OF MESENCHYMAL STEM CELLS, METHOD FOR DETERMINING THERAPEUTIC EFFECTS OF MESENCHYMAL STEM CELLS, AND CELLULAR PREPARATION CONTAINING MESENCHYMAL STEM CELLS meetings
Abstract [Problem] To provide a cellular preparation containing highly therapeutically effective mesenchymal stem cells (MSCs).
[Solution] The present invention provides a method for producing activated MSCs, the method comprising a step for using a cell culture carrier having a three-dimensional structure consisting of fibers to culture MSCs in a medium containing an activating agent derived from a mammalian fetal appendage. Also, provided are: a therapeutic effect marker of MSCs, wherein the marker is selected from the group consisting of p16ink4a, p14ARF, CDK4, CDK6, RB, and CD47; a method for determining therapeutic effects using said marker; a method for determining the adaptability of MSCs with respect to a treatment for enhancing therapeutic effects; a cell preparation containing MSCs; and a method for producing the cell preparation.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Mesenchymal stem cells (Mesenchymal stem cell, hereinafter also referred to as MSC) is, perhaps the ability to self-replicating and have the ability to a stem cell, osteoblast, chondrocyte cells, fat cells, muscle cells to differentiate into cells such as mesenchymal belonging to the well, such as hepatocytes or cells also have the ability to differentiate than definitive.In the MSC, itself produced by the liquid agent and cell adhesion interactions paracrine effect have been known.MSC is, based on these actions, the repair of the target tissue or cell, a regenerative capacity, and exhibits an anti-inflammatory such as ability to control, as a result, a variety of diseases are considered to represent the therapeutic effect.
The MSC, can be easily isolated and cultured up the force in the growth, the number of cells in a short time can be secured to the implantable, immune rejection is not a self-implantation, are less ethical issues, it is not necessary to pre-treatment by low immunogenicity allograft practical reasons, as the material of the ideal cell transplantation therapy, a treatment for various diseases has been applied to study.
The inventors of the present invention, the MSC is used to establish cell transplantation therapy in the course of, for example a diabetic patient in the patient's abnormal MSC in the MSC, specifically as described above or a variety of capability of the capability of the MSC and compared with that of a normal as a result, the effect of disease or therapeutic effect is lost as compared with the normal MSC MSC is reduced, and mammals extract from the associated MSC and activating the abnormal treatment efficacy can be restored, and such activation treatment using autografts the MSC can be found or the like, attached to mammals as an active ingredient extract from abnormal activation agent for the MSC to the invention, and filed a patent application (Patent Document 1).The activation agent is, in particular, the treatment step becomes necessary for the patient at the point of the MSC can be autografts, has important significance.
Patent Document 1 to the MSC of the activation agent is abnormal, the appendage and mammals, for example human umbilical cord tissue or as an extract from the placental tissue can be manufactured.Fortunately, including humans and mammals appendages, relatively easily available can be also expected constant supply quantity is in a biological sample.However, the application of the MSC of the cell transplantation therapy the patient is desirable, for example steadily increasing in proportion to an increase in the world a number of diabetic patients of the MSC to allow for a self-implantation, and mammals are extracted from the appendage and the supply amount of the activation agent, and will not be sufficient.
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲 [請求項1]
 哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤で間葉系幹細胞を処理する賦活化工程を含む、賦活化された間葉系幹細胞の製造方法であって、賦活化工程が、ファイバーからなる3次元構造を有する細胞培養担体を用いて、前記賦活化剤を含む培地中で間葉系幹細胞を培養する工程である、前記製造方法。

[請求項2]
 細胞培養担体が、ナノメートル~マイクロメートル単位の平均繊維径を有するファイバーによって細胞との接触面上に形成された開口部を有する、請求項1に記載の製造方法。

[請求項3]
 開口部の平均径が500nm~1000μmである、請求項2に記載の製造方法。

[請求項4]
 細胞培養担体が、生分解性ポリマーからなるナノファイバーを含有してなる細胞培養担体である、請求項1から3のいずれか一項に記載の製造方法。

[請求項5]
 培地中の賦活化剤の濃度が、ファイバーからなる3次元構造を有さない細胞培養担体を用いて間葉系幹細胞を培養する賦活化工程における培地中の賦活化剤濃度の1/10~1/100000である、請求項1から4のいずれか一項に記載の製造方法。

[請求項6]
 培地中の賦活化剤の濃度が、タンパク質換算で0.01μg/mL~500μg/mLである、請求項1から5のいずれか一項に記載の製造方法。

[請求項7]
 賦活化工程における細胞の継代回数が2回以下である、請求項1から6のいずれか一項に記載の製造方法。

[請求項8]
 間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項1から7のいずれか一項に記載の製造方法。

[請求項9]
 間葉系幹細胞が疾患を有する対象から分離された間葉系幹細胞である、請求項1から8のいずれか一項に記載の製造方法。

[請求項10]
 CD47陽性細胞の割合が2%以下である、間葉系幹細胞を含む細胞製剤。

[請求項11]
 間葉系幹細胞が、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法により製造される賦活化された間葉系幹細胞である、請求項10に記載の細胞製剤。

[請求項12]
 間葉系幹細胞集団の中からCD47陰性の間葉系幹細胞を濃縮する工程を含む、間葉系幹細胞を含む細胞製剤の製造方法。

[請求項13]
 p16 ink4a及びp14 ARFよりなる群から選択される、間葉系幹細胞の治療効果と正に相関する間葉系幹細胞の治療効果評価のためのマーカー。

[請求項14]
 CDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される、間葉系幹細胞の治療効果と負に相関する間葉系幹細胞の治療効果評価のためのマーカー。

[請求項15]
 被験間葉系幹細胞におけるp16 ink4a、p14 ARF、CDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する測定工程、測定された発現量を対照間葉系幹細胞における発現量と比較する比較工程、並びにp16 ink4a及びp14 ARFよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において多い場合並びに/又はCDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において少ない場合に、被験間葉系幹細胞は対照間葉系幹細胞より治療効果が高いと判定する判定工程を含む、間葉系幹細胞の治療効果を判定する方法。

[請求項16]
 測定工程が、被験間葉系幹細胞における
(A)DNMT1、Nanog、SOX2、OCT4、IDO、TSG6、IL-6及びTERTよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質、並びに/又は
(B)p53及びα-SMAよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質
の発現量を測定することをさらに含み、
判定工程が、p16 ink4a及びp14 ARFよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において多いこと並びに/又はCDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において少ないことに加えて、前記(A)の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において多い場合及び/又は前記(B)の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において少ない場合に、被験間葉系幹細胞は対照間葉系幹細胞より治療効果が高いと判定する工程である、請求項15に記載の方法。

[請求項17]
 請求項15又は16に記載の方法の測定工程においてCD47遺伝子又はタンパク質の発現量に代えて間葉系幹細胞中のCD47陽性細胞の割合を測定し、判定工程においてCD47遺伝子又はタンパク質の発現量が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において少ないことに代えて間葉系幹細胞中のCD47陽性細胞の割合が対照間葉系幹細胞よりも被験間葉系幹細胞において低い場合に被験間葉系幹細胞は対照間葉系幹細胞より治療効果が高いと判定する、間葉系幹細胞の治療効果を判定する方法。

[請求項18]
 被験間葉系幹細胞が、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤を含む培地中で培養された間葉系幹細胞である、請求項15から17のいずれか一項に記載の方法。

[請求項19]
 被験間葉系幹細胞が、ファイバーからなる3次元構造を有する細胞培養担体を用いて培養された間葉系幹細胞である、請求項15から18のいずれか一項に記載の方法。

[請求項20]
 被験間葉系幹細胞が、間葉系幹細胞の自家移植療法を受けようとする対象から分離された間葉系幹細胞である、請求項15から19のいずれか一項に記載の方法。

[請求項21]
 被験間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項15から20のいずれか一項に記載の方法。

[請求項22]
 処理された間葉系幹細胞におけるp16 ink4a、p14 ARF、CDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子又はタンパク質の発現量を測定する測定工程、測定された発現量を処理されていない間葉系幹細胞における発現量と比較する比較工程、並びにp16 ink4a及びp14 ARFよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において多い場合並びに/又はCDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において少ない場合に、その間葉系幹細胞は当該処理に適していると判定する判定工程を含む、間葉系幹細胞の治療効果を高めるための処理に対する間葉系幹細胞の適応性を判定する方法。

[請求項23]
 測定工程が、処理された間葉系幹細胞と処理されていない間葉系幹細胞のそれぞれにおける
(A)DNMT1、Nanog、SOX2、OCT4、IDO、TSG6、IL-6及びTERTよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質、並びに/又は
(B)p53及びα-SMAよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質
の発現量を測定することをさらに含み、
判定工程が、p16 ink4a及びp14 ARFよりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において多いこと並びに/又はCDK4、CDK6、RB及びCD47よりなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において少ないことに加えて、前記(A)の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において多い場合及び/又は前記(B)の遺伝子若しくはタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において少ない場合に、その間葉系幹細胞は当該処理に適していると判定する工程である、請求項22に記載の方法。

[請求項24]
 請求項22又は23に記載の方法の測定工程においてCD47遺伝子又はタンパク質の発現量に代えて間葉系幹細胞中のCD47陽性細胞の割合を測定し、判定工程においてCD47遺伝子又はタンパク質の発現量が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において少ないことに代えて間葉系幹細胞中のCD47陽性細胞の割合が処理されていない間葉系幹細胞よりも処理された間葉系幹細胞において低い場合にその間葉系幹細胞は当該処理に適していると判定する、処理に対する間葉系幹細胞の適応性を判定する方法。

[請求項25]
 処理が、哺乳動物の胎児付属物からの抽出物を有効成分として含有する賦活化剤を含む培地中で間葉系幹細胞を培養する処理である、請求項22から24のいずれか一項に記載の方法。

[請求項26]
 処理が、ファイバーからなる3次元構造を有する細胞培養担体を用いて間葉系幹細胞を培養する処理である、請求項22から25のいずれか一項に記載の方法。

[請求項27]
 間葉系幹細胞が、間葉系幹細胞の自家移植療法を受けようとする対象から分離された間葉系幹細胞である、請求項22から26のいずれか一項に記載の方法。

[請求項28]
 間葉系幹細胞が骨髄由来の間葉系幹細胞である、請求項22から27のいずれか一項に記載の方法。

  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • SAPPORO MEDICAL UNIVERSITY
  • Inventor
  • CHIKENJI Takako
  • FUJIMIYA Mineko
  • SAITO Yuki
  • NAKANO Masako
  • OTANI Miho
  • MIZUE Yuka
  • MATSUMURA Takashi
  • KAMIYA Kozue
IPC(International Patent Classification)
Reference ( R and D project ) (In Japanese)国立研究開発法人日本医療開発機構橋渡し研究戦略的推進プログラム

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