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METHOD FOR DETECTING HUMAN GENOMIC DNA

Foreign code F180009500
File No. S2017-0155-C0
Posted date Nov 1, 2018
Country WIPO
International application number 2017JP042943
International publication number WO 2018101375
Date of international filing Nov 30, 2017
Date of international publication Jun 7, 2018
Priority data
  • P2016-233119 (Nov 30, 2016) JP
Title METHOD FOR DETECTING HUMAN GENOMIC DNA
Abstract Provided is a method for detecting and/or assaying human genomic DNA in a test sample at high sensitivity. One "human Alu model sequence" representing the consensus sequence of 46 human Alu subfamilies is identified, and PCR primer-probe candidates for Alu detection are selected using this human Alu model sequence. Next, a primer-probe set that is an oligonucleotide sequence which hybridizes specifically with the human Alu sequence and that comprises an oligonucleotide sequence capable of minimizing dimer formation is selected using proprietary criteria. The human genomic DNA in the test sample can be detected and/or assayed at high sensitivity by conducting quantitative real-time PCR using the PCR primer-probe for Alu detection obtained in this manner.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Alu sequences, retrotransposon SINE(short interspersed element) in a kind of, including a human primate genome specific iterative sequence is present.Alu sequences, referred to as left monomer and light monomer 2 from one sequence 7SL RNA, sandwiched by them is made from the A-rich sequence.Alu sequences in the genome of a primate is a specific sequence, constitute a part of the 7SL RNA derived sequences are also present in the genome of the rodent is known.In addition, a recent study, Alu sequences in the human genome consists of a sequence of all is not the same, sub-families 46 is clear (non-patent document 1).
Alu sequences, that there be at least 100 million copies in the human genome, 10% or more of the human genome is known.A total length of approximately 30 billion nucleotides of the human genome from each pair, according to simple calculation, the average for 1 copies of DNA3000 nucleotide pairs in the human genome Alu sequence exists according to the present embodiment.Is converted into weight, of one times the weight of the whole human genome in from 3pg, 0.003fg of human genomic DNA sequences 1 included in the average is considered to be a copy of the Alu.In this way, the sequence of human genomic DNA to a very small Alu always present, further, a primate from the specific nucleotide sequence, the detection of human cells, in an ideal target for the determination of the thought.
Alu and quantitative real-time PCR method to target (hereinafter, 'Alu-qPCR' are sometimes referred to) is used to detect the human genome, is a method for the quantification, it has been reported a plurality of (for example, Patent Document 1, Non-Patent Document 2 or the like).In addition, as a kit for Alu-qPCR, Innoquant (registered trademark) (InnoGenomics Technologies Corporation) or, (registered trademark) Human DNA Quantification Kit(ZYMO RESEARCH Corporation) Femto already commercially available.Further, using Alu-qPCR, a mouse xenograft and engraftment of human stem cells, and the user can confirm the degree of growth (non-patent document 3), DNA concentration was measured in the blood of cancer diagnosis (Non-Patent Document 4) can be, the element used in the field of forensic human genomic DNA in the sample can be detected to have been reported (Non-Patent Document 5).
However, have been reported so far either Alu-qPCR not have sufficient sensitivity.That is, in theory, real-time PCR DNA from the human genome of approximately 0.1fg by Alu can be detected which should, in one or more known Alu-qPCR pg of human genomic DNA is the number required (non-patent document 5) and, compared to the theoretical limit of detection is not only a very low sensitivity.Also, in known Alu-qPCR primers, non-human species of the same portion of the genome and the nucleotide sequence, genomic DNA derived from other species of the human genome and DNA may be mixed with the case of using a sample, specifically Alu trace was impossible to detect.From the above, has a higher sensitivity and specificity of Alu-qPCR development has been demanded.
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲
[請求項1]
 配列番号4に示されるヌクレオチド配列からなるヒトAluモデル配列の一部又は全部の領域を増幅することができるフォワードプライマー群及びリバースプライマー群から、以下のクライテリア1’~7’を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーを選択する工程A’を含む、ヒトAlu検出用PCRプライマー対の設計方法;
 [クライテリア1’]フォワードプライマー及びリバースプライマー中の連続した17以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される1種又は2種以上のゲノムDNAのヌクレオチド配列中に2ヶ所以上存在しない;
 [クライテリア2’]フォワードプライマー及びリバースプライマーのヌクレオチド長がそれぞれ18以上である;
 [クライテリア3’]少なくともプライマーの5’末端又は3’末端のヌクレオチドがG又はCであり、プライマーの5’末端がG又はCでない場合は、5’末端から2番目のヌクレオチドがG又はCであり、プライマーの3’末端がG又はCでない場合は、3’末端から2番目のヌクレオチドがG又はCである;
 [クライテリア4’]プライマーの3’末端から3番目までのヌクレオチド(3’末端から1~3番目のヌクレオチド)のうちの、少なくとも1つがA又はTである;
 [クライテリア5’]フォワードプライマー同士、及びリバースプライマー同士の二分子間において、いずれか一方の分子の3’末端から3番目までのヌクレオチド配列(3’末端から1~3番目のヌクレオチド配列)と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない;
 [クライテリア6’]フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する5ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない;
 [クライテリア7’]フォワードプライマー同士、及びリバースプライマー同士の二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるG又はCからなる連続する4ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない;
[請求項2]
 以下のクライテリア1~7を満たすフォワードプライマー及びリバースプライマーを選択する工程Aを含む、請求項1記載のヒトAlu検出用PCRプライマー対の設計方法;
 [クライテリア1]フォワードプライマー及びリバースプライマー中の連続した19ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される1種又は2種以上のゲノムDNAのヌクレオチド配列中に2ヶ所以上存在しない;
 [クライテリア2]フォワードプライマー及びリバースプライマーのヌクレオチド長がそれぞれ20以上である;
 [クライテリア3]少なくともプライマーの5’末端又は3’末端のヌクレオチドがG又はCであり、プライマーの5’末端がG又はCでない場合は、5’末端から2番目のヌクレオチドがG又はCであり、プライマーの3’末端がG又はCでない場合は、3’末端から2番目のヌクレオチドがG又はCである;
 [クライテリア4]プライマーの3’末端から3番目までのヌクレオチド(3’末端から1~3番目のヌクレオチド)のうちの、少なくとも1つがA又はTである;
 [クライテリア5]フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子の3’末端から3番目までのヌクレオチド配列(3’末端から1~3番目のヌクレオチド配列)と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない;
 [クライテリア6]フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する5ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない;
 [クライテリア7]フォワードプライマー同士、リバースプライマー同士、及びフォワードプライマーとリバースプライマーの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるG又はCからなる連続する4ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない;
[請求項3]
 ヒトAluモデル配列が配列番号5に示されるヌクレオチド配列からなる、請求項1又は2記載のヒトAlu検出用PCRプライマー対の設計方法。
[請求項4]
 非ヒト生物がげっ歯類である請求項1~3のいずれかに記載のヒトAlu検出用PCRプライマー対の設計方法。
[請求項5]
 請求項1~4のいずれかに記載のヒトAlu検出用PCRプライマー対の設計方法により設計されたヒトAlu検出用PCRプライマー対。
[請求項6]
 以下の(a)又は(a’)のフォワードプライマー及び(b)又は(b’)のリバースプライマーにより構成される、ヒトAlu検出用PCRプライマー対。
(a)配列番号18に示されるヌクレオチド配列;又は配列番号18に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する16ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号18に示されるヌクレオチド配列において1若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列;からなるフォワードプライマー;
(a’)配列番号123に示されるヌクレオチド配列;又は配列番号123に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する16ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号123に示されるヌクレオチド配列において1若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列;からなるフォワードプライマー;
(b)配列番号19に示されるヌクレオチド配列;又は配列番号19に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する16ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号19に示されるヌクレオチド配列において1若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列;からなるリバースプライマー;
(b’)配列番号148に示されるヌクレオチド配列;又は配列番号148に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する16ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号148に示されるヌクレオチド配列において1若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列;からなるリバースプライマー;
[請求項7]
 配列番号18に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー、及び配列番号19に示されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマーにより構成される、請求項6記載のヒトAlu検出用PCRプライマー対。
[請求項8]
 配列番号123に示されるヌクレオチド配列からなるフォワードプライマー、及び配列番号148に示されるヌクレオチド配列からなるリバースプライマーにより構成される、請求項6記載のヒトAlu検出用PCRプライマー対。
[請求項9]
 被験試料より抽出されたDNAを鋳型として、請求項5~8のいずれかに記載のヒトAlu検出用PCRプライマー対を用いたPCRを行う工程を含む、前記被験試料中のヒトゲノムDNAを検出及び/又は定量する方法。
[請求項10]
 被験試料が、非ヒト動物にヒト細胞を移植して作製された異種移植モデル動物由来の生体試料、又は古人骨由来の陳旧試料である、請求項9記載の方法。
[請求項11]
 配列番号4に示されるヌクレオチド配列からなるヒトAluモデル配列のうち、請求項5~8のいずれかに記載のヒトAlu検出用PCRプライマー対により増幅される領域にハイブリダイズすることができるプローブの群から、以下のクライテリア8’~11’を満たすプローブを選択する工程B’を含む、ヒトAlu検出用PCRプローブの設計方法;
 [クライテリア8’]プローブ中の連続した17以上のヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される1種又は2種以上のゲノムDNAのヌクレオチド配列中に2ヶ所以上存在しない;
 [クライテリア9’]プローブのヌクレオチド長が18以上である;
 [クライテリア10’]フォワードプライマーとプローブ及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子の3’末端から3番目までのヌクレオチド配列(3’末端から1~3番目のヌクレオチド配列)と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない;
 [クライテリア11’]プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する5ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない;
[請求項12]
 以下のクライテリア8~11を満たすプローブを選択する工程Bを含む、請求項11記載のヒトAlu検出用PCRプローブの設計方法;
 [クライテリア8]プローブ中の連続した19ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列が、非ヒト生物からなる群から選択される1種又は2種以上のゲノムDNAのヌクレオチド配列中に2ヶ所以上存在しない;
 [クライテリア9]プローブのヌクレオチド長が20以上である;
 [クライテリア10]プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子の3’末端から3番目までのヌクレオチド配列(3’末端から1~3番目のヌクレオチド配列)と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない;
 [クライテリア11]プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれる連続する5ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない;
[請求項13]
 工程B’又はBにより複数のプローブが選択されたとき、以下のクライテリア12~15の少なくとも1つ又は2つ以上を満たすプローブを選択する工程Cをさらに含む、請求項11又は12記載のヒトAlu検出用PCRプローブの設計方法。
 [クライテリア12]フォワードプライマーとプローブ、又はリバースプライマーとプローブの二分子間において、いずれか一方の分子に含まれるG又はCからなる連続する4ヌクレオチド以上のヌクレオチド配列と相補的なヌクレオチド配列を、もう一方の分子が含まない;
 [クライテリア13]プローブの5’末端のヌクレオチドがGでない;
 [クライテリア14]プローブ同士、フォワードプライマーとプローブ、及びリバースプライマーとプローブの二分子間で、最も安定なダイマーを形成させた場合の自由エネルギーの変化が-7kcal/mol以上である;
[クライテリア15]ヌクレオチド長が最も短い;
[請求項14]
 ヒトAluモデル配列が配列番号5に示されるヌクレオチド配列からなる、請求項11~13のいずれかに記載のヒトAlu検出用PCRプローブの設計方法。
[請求項15]
 非ヒト生物がげっ歯類である、請求項11~14のいずれかに記載のヒトAlu検出用PCRプローブの設計方法。
[請求項16]
 請求項11~15のいずれかに記載のヒトAlu検出用PCRプローブの設計方法により設計された、ヒトAlu検出用PCRプローブ。
[請求項17]
 配列番号37、39、42、47若しくは149に示されるヌクレオチド配列;又は配列番号37、39、42、47若しくは149に示されるヌクレオチド配列中の少なくとも連続する16ヌクレオチドからなるヌクレオチド配列を含み、且つ、配列番号37、39、42、47若しくは149に示されるヌクレオチド配列において1若しくは数個のヌクレオチドが欠失、置換、若しくは付加されたヌクレオチド配列;からなるヒトAlu検出用PCRプローブ。
[請求項18]
 配列番号42又は149に示されるヌクレオチド配列からなる、請求項17記載のヒトAlu検出用PCRプローブ。
[請求項19]
 プローブの5’末端が蛍光物質により、3’末端がクエンチャー物質によりそれぞれ標識されている、請求項16~18のいずれかに記載のヒトAlu検出用PCRプローブ。
[請求項20]
 請求項5~8のいずれかに記載のヒトAlu検出用PCRプライマー対と、請求項16~19のいずれかに記載のヒトAlu検出用PCRプローブとを備えた、ヒトAlu検出用PCRプライマー・プローブセット。
[請求項21]
 請求項20記載のヒトAlu検出用PCRプライマー・プローブセットを用いて被験試料中のヒトゲノムDNAを検出及び/又は定量する方法であって、以下の(I)~(III)の工程を含む、方法。
(I)前記被験試料より抽出されたDNAを鋳型として、前記プライマー・プローブセットを用いたリアルタイムPCRを行う工程;
(II)既知量のヒトゲノムDNAを段階希釈して調製された標準試料を鋳型として、上記工程(I)と同様の条件においてリアルタイムPCRを行い、検量線を作成する工程;
(III)前記検量線から、前記被験試料中のヒトゲノムDNA量を算出する工程;
[請求項22]
 被験試料が、非ヒト動物にヒト細胞を移植して作製された異種移植モデル動物由来の生体試料、又は古人骨由来の陳旧試料である、請求項21記載の方法。
[請求項23]
 請求項5~8のいずれかに記載のヒトAlu検出用PCRプライマー対及び/又は請求項16~18のいずれかに記載のヒトAlu検出用PCRプローブを備えた、ヒトゲノムDNA検出及び/又は定量用キット。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • AKITA UNIVERSITY
  • Inventor
  • AKASHI, Hideo
  • FUNAKOSHI, Kodai
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JO JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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