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METHOD FOR DETECTING MITOCHONDRIAL tRNA MODIFICATION

Foreign code F180009502
File No. S2017-0228-C0
Posted date Nov 1, 2018
Country WIPO
International application number 2017JP047099
International publication number WO 2018124235
Date of international filing Dec 27, 2017
Date of international publication Jul 5, 2018
Priority data
  • P2016-255808 (Dec 28, 2016) JP
Title METHOD FOR DETECTING MITOCHONDRIAL tRNA MODIFICATION
Abstract The purpose of the present invention is to provide a method for detecting a modified nucleoside of mitochondrial transition RNA (mt-tRNA). The present invention provides a method for detecting a modified nucleoside in mt-tRNA, the method using tandem mass analysis, and including detecting a modified nucleoside (for example, 5-taurinomethyl-2-thiouridine (τ m5s2U)), 5-taurinomethyluridine (τ m5U), or 2-methylthio-N6-isopentenyl adenosine (ms2i6A)) in a specimen of a bodily fluid such as urine or in a specimen in a culture supernatant.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Mitochondrial DNA is derived from mitochondrial RNA (tRNA) the transition type 22 is present, also derived from mitochondrial DNA in 13 kinds of protein is essential for the translation.Mt-tRNA is known to contain a number of chemical modifications and, to this base of the mt-tRNA, where the total of 118 types of chemical modifications at the base 15 have been identified.For example, of the mt-tRNA, tRNA is the first one 5 of the modification 34 of the uridine taurine.Wherein, mt-tRNALeu and mt-tRNATrp is taurinomechiru of (τm5 U) and, mt-tRNAGln, mt-tRNAGlu and mt-tRNALys taurinomethyl thiol-is (τm5 s2 U) (Fig. 1) is.Also, mt-tRNATrp is, the modified 37 th ms or adenosine2 i6 Aare.
Taurine in mitochondria modified findings of importance of the patient from the mitochondria has been suggested (Non-Patent Document 1).Also, ms2 i6 Amitochondrial disease has been implicated.Mitochondrial DNA of a mitochondrial disease is mainly due to point mutations, many of the energy demands of skeletal muscle cardiac disease genetic disorders.By way of example, one of the mitochondrial DNA point mutations, mt-tRNALeu encoding DNA generated in an area A3243G point mutations, and mt-tRNALys DNA encoding A8344G occurs in areas of particularly high frequency of point mutations.Interestingly, a point mutation in patients with A3243G, mt-tRNALeu of τm5 modification has been lost.In addition, has point mutations in mitochondrial disease patients A8344G, mt-tRNALys of τm5 s2 modification has been lost.From these, mitochondrial disease due to the reduction of the development of modified taurine is strongly suggested.
That is, starting with a uridine nucleoside taurine modified by analyzing the amount of modified, mitochondrial disease can be diagnosed.However, in the prior art, for example, to analyze the modified uridine taurine, a large amount of muscle tissue from the patient and must be collected, a mitochondrial disease onset of many children in the diagnosis cannot be applied.
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲
[請求項1]
 被検動物におけるミトコンドリアtRNA(mt-tRNA)中に含まれる修飾ヌクレオシドの量を決定する方法であって、以下の工程:
(1)該被検動物由来の体液試料及び該被検動物由来の細胞の培養上清からなる群より選択される試料中の修飾ヌクレオシドの量を、タンデム質量分析法を用いて決定する工程、および
(2)工程(1)により決定された試料中の修飾ヌクレオシド量が、被検動物におけるmt-tRNAにおける該修飾ヌクレオシドの量に関連付けられる工程、
を含む方法。
[請求項2]
 前記タンデム質量分析法が、前処理として液体クロマトグラフィー(LC)を含みイオン化源がエレクトロスプレーイオン化源(ESI)であるLC-ESI-MS/MSであり、かつ、使用される質量分析モードが選択反応モニタリングである、請求項1に記載の方法。
[請求項3]
 前記試料が、被検動物由来の尿を含む請求項1又は2に記載の方法。
[請求項4]
 前記試料がメタノールにより除タンパク処理された尿試料である、請求項3に記載の方法。
[請求項5]
 前記試料が、ミトコンドリア病を疑われるヒトからの尿試料である、請求項1~4のいずれか一つに記載の方法。
[請求項6]
 さらに以下の工程:
(3)工程(2)により関連づけられた被検動物におけるmt-tRNAにおける修飾ヌクレオシド量が、該被検動物におけるミトコンドリア病の疾患の程度に関連づけられる工程、を含む、請求項1~5のいずれか一つに記載の方法。
[請求項7]
 前記修飾ヌクレオシドが、タウリン修飾ウリジンである請求項1~5のいずれか一つに記載の方法。
[請求項8]
 前記タウリン修飾ウリジンが、5-タウリノメチル 2-チオウリジン(τm 5s 2U)である請求項7に記載の方法。
[請求項9]
 前記工程(1)が、
(a)τm 5s 2Uを含有することが疑われる試料を液体クロマトグラフィーに供してτm 5s 2Uが濃縮された画分を得る工程、
(b)質量分析により検出し得るτm 5s 2U前駆イオンを発生させるのに適した条件下で、τm 5s 2Uが濃縮された画分をイオン化源に供する工程、及び
(c)タンデム質量分析(MS/MS)によりτm 5s 2U生成イオンの量を決定する工程、
を含み、
工程(c)におけるタンデム質量分析(MS/MS)が、396±0.5の質量対電荷比(m/z)を有する前駆負イオンを、τm 5s 2U前駆負イオンが124±0.5のm/zを有するτm 5s 2U生成負イオンを発生する条件下で、衝突反応に付し、該衝突反応により生じた124±0.5のm/zを有する生成イオン量を決定することを含み、
工程(c)で決定されたイオンの量が、前記試料中のτm 5s 2Uの量に関連づけられる工程である、請求項8に記載の方法。
[請求項10]
 前記試料が、被検動物由来の尿をメタノールにより除タンパク処理した尿試料である請求項9に記載の方法。
[請求項11]
 前記タウリン修飾ウリジンが、5-タウリノメイルウリジン(τm 5U)である請求項7に記載の方法。
[請求項12]
 前記工程(1)が、
(a)τm 5Uを含有することが疑われる試料を液体クロマトグラフィーに供してτm 5Uが濃縮された画分を得る工程、
(b)質量分析により検出し得るτm 5U前駆イオンを発生させるのに適した条件下で、τm 5Uが濃縮された画分をイオン化源に供する工程、及び
(c)タンデム質量分析(MS/MS)によりτm 5U生成イオンの量を決定する工程、
を含み、
工程(c)におけるタンデム質量分析(MS/MS)が、380±0.5の質量対電荷比(m/z)を有する前駆負イオンを、τm 5U前駆負イオンが124±0.5のm/zを有するτm 5U生成負イオンを発生する条件下で、衝突反応に付し、該衝突反応により生じた124±0.5のm/zを有する生成イオン量を決定することを含み、
工程(c)で決定されたイオンの量が、前記試料中のτm 5Uの量に関連づけられる工程、である請求項11に記載の方法。
[請求項13]
 前記試料が、被検動物由来の尿をメタノールにより除タンパク処理した尿試料である請求項12に記載の方法。
[請求項14]
 前記修飾ヌクレオシドが、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデノシン(ms 2i 6A)である請求項1~5のいずれか一つに記載の方法。
[請求項15]
 前記工程(1)が、
(a)ms 2i 6Aを含有することが疑われる試料を液体クロマトグラフィーに供してms 2i 6Aが濃縮された画分を得る工程、
(b)質量分析により検出し得るms 2i 6A前駆イオンを発生させるのに適した条件下で、ms 2i 6Aが濃縮された画分をイオン化源に供する工程、及び
(c)タンデム質量分析(MS/MS)によりms 2i 6A生成イオンの量を決定する工程、
を含み、
工程(c)におけるタンデム質量分析(MS/MS)が、382±0.5の質量対電荷比(m/z)を有する前駆正イオンを、ms 2i 6A前駆正イオンが182±0.5のm/zを有するms 2i 6A生成正イオンを発生する条件下で、衝突反応に付し、該衝突反応により生じた182±0.5のm/zを有する生成イオン量を決定することを含み、
工程(c)で決定されたイオンの量が、前記試料中のms 2i 6Aの量に関連づけられる工程、である請求項14に記載の方法。
[請求項16]
 前記試料が、被検動物由来の尿をメタノールにより除タンパク処理した尿試料である請求項15に記載の方法。
[請求項17]
 タンデム質量分析により試料中のτm 5s 2Uの量を決定する方法であって、
(a)τm 5s 2Uを含有することが疑われる試料を液体クロマトグラフィーに供してτm 5s 2Uが濃縮された画分を得る工程と、
(b)質量分析により検出し得るτm 5s 2U前駆イオンを発生させるのに適した条件下で、τm 5s 2Uが濃縮された画分をイオン化源に供する工程と、
(c)タンデム質量分析によりτm 5s 2U生成イオンの量を決定する工程とを含み、
工程(c)におけるタンデム質量分析が、396±0.5の質量対電荷比(m/z)を有する前駆負イオンを、τm 5s 2U前駆負イオンが124±0.5のm/zを有するτm 5s 2U生成負イオンを発生する条件下で、衝突反応に付し、該衝突反応により生じた124±0.5のm/zを有する生成イオン量を決定することを含み、
工程(c)で決定されたイオンの量が、前記試料中のτm 5s 2Uの量に関連づけられる、方法。
[請求項18]
 タンデム質量分析により試料中のτm 5Uの量を決定する方法であって、
(a)τm 5Uを含有することが疑われる試料をLCに供してτm 5Uが濃縮された画分を得る工程と、
(b)質量分析により検出し得るτm 5U前駆イオンを発生させるのに適した条件下で、τm 5Uが濃縮された画分をイオン化源に供する工程と、
(c)タンデム質量分析によりτm 5U生成イオンの量を決定する工程とを含み、
工程(c)におけるタンデム質量分析が、380±0.5の質量対電荷比(m/z)を有する前駆負イオンを、τm 5U前駆負イオンが124±0.5のm/zを有するτm 5U生成負イオンを発生する条件下で、衝突反応に付し、該衝突反応により生じた124±0.5のm/zを有する生成イオン量を決定することを含み、
工程(c)で決定されたイオンの量が、前記試料中のτm 5Uの量に関連づけられる、方法。
[請求項19]
 タンデム質量分析により試料中のms 2i 6Aの量を決定する方法であって、
(a)ms 2i 6Aを含有することが疑われる試料をLCに供してms 2i 6Aが濃縮された画分を得る工程と、
(b)質量分析により検出し得るms 2i 6A前駆イオンを発生させるのに適した条件下で、ms 2i 6Aが濃縮された画分をイオン化源に供する工程と、
(c)タンデム質量分析によりms 2i 6A生成イオンの量を決定する工程とを含み、
工程(c)におけるタンデム質量分析が、382±0.5の質量対電荷比(m/z)を有する前駆正イオンを、ms 2i 6A前駆正イオンが182±0.5のm/zを有するms 2i 6A生成正イオンを発生する条件下で、衝突反応に付し、該衝突反応により生じた182±0.5のm/zを有する生成イオン量を決定することを含み、
工程(c)で決定されたイオンの量が、前記試料中のms 2i 6Aの量に関連づけられる、方法。
[請求項20]
 前記イオン化源がエレクトロスプレーイオン化源である、請求項17~19のいずれか一つに記載の方法。
[請求項21]
 試料が体液試料又は細胞培養上清を含む、請求項17~20のいずれか一項に記載の方法。
[請求項22]
 試料が尿を含む、請求項17~20のいずれか一項に記載の方法。
[請求項23]
 試料が、除タンパク処理された体液試料又は細胞培養上清である、請求項17~22のいずれか一項に記載の方法。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION KUMAMOTO UNIVERSITY
  • Inventor
  • TOMIZAWA, Kazuhito
  • WEI, Fanyan
IPC(International Patent Classification)
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