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METHOD FOR REPLICATING OR AMPLIFYING CIRCULAR DNA

Foreign code F180009530
File No. (IP14P003)
Posted date Nov 2, 2018
Country WIPO
International application number 2018JP007485
International publication number WO 2018159669
Date of international filing Feb 28, 2018
Date of international publication Sep 7, 2018
Priority data
  • P2017-037489 (Feb 28, 2017) JP
Title METHOD FOR REPLICATING OR AMPLIFYING CIRCULAR DNA
Abstract Provided is a method that enables replication or amplification of circular DNA, particularly long-chain circular DNA, in a cell-free system. Specifically, provided is a method for inhibiting generation of a DNA multimer which is a by-product, during replication or amplification of circular DNA having a replication initiation sequence (origin of chromosome (oriC)) by using the following enzymes: (1) first enzymes which catalyze replication of the circular DNA; (2) second enzymes which catalyze an Okazaki fragment linking reaction, to synthesize two sister circular DNA molecules forming a catenane; and (3) third enzymes which catalyze a separation reaction of the two sister circular DNA molecules. Further provided is a method that comprises introduction of oriC into circular DNA by using a transposon.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
Development of biotechnology is DNA cloning techniques are based, DNA fragments were prepared by the paste within the cells such as Escherichia coli plasmid DNA to be annular as a method of amplifying.DNA cloning techniques were used to amplify the DNA in the case of annular, cell culture and the extraction of the amplification product, such as purified and a complicated procedure is required.In addition, cells were used for cloning the gene DNA is necessary to produce a recombinant organism, to limitations in the experimental environment.
In vitro DNA amplification methods include, polymerase chain reaction (PCR) is generally used.However, the test tube by PCR DNA amplification method, the DNA is amplified as it is not annular.In vitro DNA amplification methods include an annular, rolling circle amplification (RCA) method and the like (Non-Patent Document 1, Patent Document 1, Patent Document 2, Patent Document 3).However, the rolling-circle amplification method for amplifying DNA is annular, every target DNA with primers specific for the design.In addition, direct rolling circle DNA amplification products is straight-chain, the amplification products obtained in order to make an annular shape, such as recombinant enzyme incubated with an annular step is further required. E. coli chromosome replication (oriC cyclic DNA) mini and then, this was separated, the single amount of the annular body to obtain the replication products have been reported (Non-Patent Document 2-5).However, these documents used in the reaction conditions, as the DNA molecule is a cyclic copy of the efficiency, of the template DNA were added to about 15-40% and remains, as does not reach twice the amplification amount can be shown experimentally (Non-Patent Document 3-6).Further, in these documents is used as the template 10 kbp remains less than the size of the circular DNA.
In this way, the in vitro DNA amplification method in the prior art for amplifying DNA is annular, the binding of the primer DNA template is necessary, and DNA amplification products is straight-chain, in addition, the number of amplifiable DNA was kbp size remains.Further, E. coli chromosomal replication system is used in the mini-ring to produce amplified product of the case, an annular template DNA is not amplified even times a problem.
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲
[請求項1]
 無細胞系における環状DNAの複製方法であって、以下の工程:
(1)鋳型となる環状DNAと、以下:
 環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群、
 岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群、および
 2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群、
を含む反応液との反応混合物を形成する工程;および
(2)工程(1)において形成した反応混合物を反応させる工程;
を含み、
ここで当該環状DNAは、DnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列(origin of chromosome(oriC))を含み、そして、oriCに対してそれぞれ外向きに挿入された1対のter配列、および/または、DNAマルチマー分離酵素が認識する塩基配列、をさらに含み、
ここで当該環状DNAがter配列を有する場合、前記工程(1)の反応液はさらにter配列に結合して複製を阻害する活性を有するタンパク質を含み、そして当該環状DNAがDNAマルチマー分離酵素が認識する塩基配列を有する場合、前記工程(1)の反応液はさらにDNAマルチマー分離酵素を含む、
前記方法。
[請求項2]
 DNAマルチマー分離酵素がCreまたはXerCDである、請求項1に記載の方法。
[請求項3]
 oriCに対してそれぞれ外向きに挿入された1対のter配列が、一方のter配列としてoriCの5’側に配列番号1~14に示される配列のいずれか1つを含む配列が挿入され、他方のter配列としてoriCの3’側に配列番号1~14に示される配列の相補配列を含む配列が挿入されたものである、請求項1または2に記載の方法。
[請求項4]
 ter配列に結合して複製を阻害する活性を有するタンパク質が、Tusタンパク質またはRTPタンパク質である、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の方法。
[請求項5]
 XerCDが認識する塩基配列が、配列番号15~24に示される配列のいずれか1つを含む配列またはその相補配列である、請求項2に記載の方法。
[請求項6]
 Creが認識する塩基配列が、配列番号30~35に示される配列のいずれか1つを含む配列またはその相補配列である、請求項2に記載の方法。
[請求項7]
 核酸であって、273bp~2.0kbの長さを有する線状DNAであり、oriC、ならびに、oriCに対してそれぞれ外向きに挿入された1対のter配列および/またはDNAマルチマー分離酵素が認識する塩基配列を含む、前記核酸。
[請求項8]
 無細胞系における環状DNAの複製方法であって、以下の工程:
(1)oriCトランスポゾンとトランスポゼースを緩衝液中に添加してoriCトランスポゾームを形成する、ここでoriCトランスポゾンはDnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列(origin of chromosome(oriC))を含む線状DNAであってその両末端にOutside end (OE) 配列を含む線状DNAである;および
 oriCトランスポゾームとoriCを含まない環状DNAを緩衝液中で反応させて転移反応を行う;
ことにより、oriCを含む環状DNAを調製する工程;
(2)(1)で得られたoriCを含む環状DNAと、以下:
 環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群、
 岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群、および
 2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群、
を含む反応液との反応混合物を形成する工程;および
(3)工程(2)において形成した反応混合物を反応させる工程;
を含む、前記方法。
[請求項9]
 OE配列が、配列番号25(5’-CTGTCTCTTATACACATCT-3’)で示される配列およびその相補配列を含み、工程(1)の線状DNAの5’末端に配列番号25で示される配列を含むOE配列が挿入されており、当該線状DNAの3’末端に配列番号25で示される配列の相補配列を含むOE配列が挿入されている、請求項8に記載の方法。
[請求項10]
 oriCを含む環状DNAがさらに、oriCに対してそれぞれ外向きに挿入された1対のter配列、および/または、DNAマルチマー分離酵素が認識する塩基配列、を含み、
ここで当該環状DNAがter配列を有する場合、前記工程(2)の反応液はさらにter配列に結合して複製を阻害する活性を有するタンパク質を含み、そして当該環状DNAがDNAマルチマー分離酵素が認識する塩基配列を有する場合、前記工程(2)の反応液はさらにDNAマルチマー分離酵素を含む、
請求項8または9に記載の方法。
[請求項11]
 工程(1)のoriCトランスポゾンがoriCに対してそれぞれ外向きに挿入された1対のter配列、および/または、DNAマルチマー分離酵素が認識する塩基配列、をさらに含み、
ここで当該線状DNAがter配列を有する場合、前記工程(2)の反応液はさらにter配列に結合して複製を阻害する活性を有するタンパク質を含み、そして当該環状DNAがDNAマルチマー分離酵素が認識する塩基配列を有する場合、前記工程(2)の反応液はさらにDNAマルチマー分離酵素を含む、
請求項8ないし10のいずれか1項に記載の方法。
[請求項12]
 さらに、(4)工程(3)の反応物において複製または増幅された環状DNAからoriCトランスポゾンを除去する工程を含む、請求項8ないし11のいずれか1項に記載の方法。
[請求項13]
 核酸であって、311bp~2.0kbの長さを有する線状DNAであり、oriC、ならびに、oriCに対してそれぞれ外向きに挿入された1対のter配列および/またはDNAマルチマー分離酵素が認識する塩基配列を含み、そして両末端にOutside end (OE) 配列を含む、前記核酸。
[請求項14]
 環状DNAの複製用キットであって、
 環状DNAの複製を触媒する第一の酵素群;
 岡崎フラグメント連結反応を触媒して、カテナンを形成する2つの姉妹環状DNAを合成する第二の酵素群;
 2つの姉妹環状DNAの分離反応を触媒する第三の酵素群;
 oriCトランスポゾン、ここでoriCトランスポゾンはDnaA活性を有する酵素と結合可能な複製開始配列(origin of chromosome(oriC))を含む線状DNAであってその両末端にOutside end (OE) 配列を含む線状DNAである;および
 トランスポゼース;
の組み合わせを含む、前記キット。
[請求項15]
 oriCトランスポゾンが、oriCに対してそれぞれ外向きに挿入された1対のter配列、および/または、DNAマルチマー分離酵素が認識する塩基配列、をさらに含む、請求項14に記載のキット。
[請求項16]
 ter配列に結合して複製を阻害する活性を有するタンパク質;および/または、
 DNAマルチマー分離酵素;
をさらに含む、請求項15に記載のキット。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • JAPAN SCIENCE AND TECHNOLOGY AGENCY
  • Inventor
  • SU'ETSUGU, Masayuki
  • NARA, Seia
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JO JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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