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MAINTENANCE CULTURE OF INTESTINAL STEM CELLS DERIVED FROM INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS

Foreign code F180009548
File No. (S2017-0284-N0)
Posted date Nov 2, 2018
Country WIPO
International application number 2018JP005849
International publication number WO 2018151307
Date of international filing Feb 20, 2018
Date of international publication Aug 23, 2018
Priority data
  • P2017-029448 (Feb 20, 2017) JP
Title MAINTENANCE CULTURE OF INTESTINAL STEM CELLS DERIVED FROM INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS
Abstract The present invention addresses the problem of providing a culture method with which it is possible to maintain and culture intestinal stem cells derived from induced pluripotent stem cells while maintaining the properties of the intestinal stem cells. Intestinal stem cells derived from induced pluripotent stem cells are cultured in the presence of a GSK-3β inhibitor, a histone deacetylation inhibitor, and a serum substitute, or in the presence of a GSK-3β inhibitor and a serum substitute. Preferably, the cells are cultured under conditions such that one or more compounds selected from the group consisting of epidermal growth factors, TGFβ receptor inhibitors, and fibroblast growth factors are also present.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
The drug-metabolizing enzyme and a number of the small intestine is present in the drug transporter, similar to the liver, according to the first-pass effect of the drug as an organ is very important.Therefore, the small intestine from the early stages of drug development of pharmaceuticals in the membrane permeability of the evaluation and metabolism, pharmacokinetic properties required for the development of pharmaceutical products is excellent.The current, derived from the small intestine of the human colon cancer is as a model system is widely used in the Caco-2 cells.However, drug transporter Caco-2 cells is different from the expression patterns of human small intestine.In addition, the drug-metabolizing enzyme in the Caco-2 cell expression and enzyme induction is not found substantially, accurately evaluate the pharmacokinetics of the small intestine is difficult.Therefore, in the small intestine and the membrane permeability in drug metabolism for comprehensively evaluating the use of the small intestine epithelial cells is desirable that the primary, it is difficult to obtain primary small intestine epithelial cells.
Therefore, human embryonic stem cell (embryonic stem cells: ES cells) in the same manner as the growth of an almost infinite and multipotent and pluripotent stem cells have the ability to human artificial (induced pluripotent stem cells: cell iPS) cells of the intestinal epithelium made is expected to be used.
Incidentally, in the gastrointestinal tract from the intestinal tract of a living organism isolated stem cells, intestinal epithelial cells in vitro culturing the stem cells of the intestinal tract or iPS cells and a technique to induce the differentiation of human intestinal epithelial cells from the technology has been reported that some (for example JP-1-4, see Non-Patent Document 1-3), human iPS cells from stem cell maintenance or growth in the gastrointestinal tract for the purpose has not been reported in culture techniques.
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲
[請求項1]
 人工多能性幹細胞由来の腸管幹細胞様細胞をGSK-3β阻害剤、ヒストン脱アセチル化阻害剤、及び血清代替物の存在下、或いはGSK-3β阻害剤及び血清代替物の存在下で培養する工程を含む、人工多能性幹細胞由来の腸管幹細胞様細胞を培養する方法。
[請求項2]
 GSK-3β阻害剤がCHIR 99021、SB216763、CHIR 98014、TWS119、Tideglusib、SB415286、BIO、AZD2858、AZD1080、AR-A014418、TDZD-8、LY2090314、IM-12、Indirubin、Bikinin又は1-Azakenpaulloneであり、ヒストン脱アセチル化阻害剤がバルプロ酸、ボリノスタット、トリコスタチンA、ツバスタチンA、ギビノスタット又はプラシノスタットであり、血清代替物がノックアウト血清代替物である、請求項1に記載の方法。
[請求項3]
 前記培養が、上皮成長因子、TGFβ受容体阻害剤及び線維芽細胞増殖因子からなる群より選択される一以上の化合物が更に存在する条件下で行われる、請求項1又は2に記載の方法。
[請求項4]
 TGFβ受容体阻害剤がA-83-01であり、線維芽細胞増殖因子がFGF2、FGF4又はFGF10である、請求項3に記載の方法。
[請求項5]
 前記培養が、BMP阻害剤、Wntシグナル活性化剤及びWntアゴニストからなる群より選択される一以上の化合物が更に存在する条件下で行われる、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
[請求項6]
 BMP阻害剤がNogginであり、Wntシグナル活性化剤がR-spondin 1であり、WntアゴニストがWnt3aである、請求項5に記載の方法。
[請求項7]
 前記培養が、ニコチンアミド、N-アセチルシステイン、p38阻害剤及びROCK阻害剤からなる群より選択される一以上の化合物が更に存在する条件下で行われる、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法。
[請求項8]
 p38阻害剤がSB202190であり、ROCK阻害剤がY-27632である、請求項7に記載の方法。
[請求項9]
 人工多能性幹細胞がヒト人工多能性幹細胞である、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法。
[請求項10]
 請求項1~9のいずれか一項に記載の方法で培養した腸管幹細胞様細胞を腸管上皮細胞様細胞へと分化させる工程を含む、腸管上皮細胞様細胞を調製する方法。
[請求項11]
 請求項10に記載の方法で得られた腸管上皮細胞様細胞。
[請求項12]
 請求項11に記載の腸管上皮細胞様細胞を用いた、被検物質の体内動態又は毒性を評価する方法。
[請求項13]
 前記体内動態が、代謝、吸収、排泄、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、又は薬物トランスポーターの誘導である、請求項12に記載の方法。
[請求項14]
 以下の工程(i)~(iii)を含む、請求項12又は13に記載の方法:
 (i)請求項11に記載の腸管上皮細胞様細胞で構成された細胞層を用意する工程;
 (ii)前記細胞層に被検物質を接触させる工程;
 (iii)前記細胞層を透過した被検物質を定量し、被検物質の吸収性ないし膜透過性、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を評価する工程。
[請求項15]
 以下の工程(I)及び(II)を含む、請求項12又は13に記載の方法:
 (I)請求項11に記載の腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程;
 (II)被検物質の代謝若しくは吸収、薬物相互作用、薬物代謝酵素の誘導、薬物トランスポーターの誘導、又は毒性を測定・評価する工程。
[請求項16]
 以下の工程(a)及び(b)を含む、被検物質の消化管粘膜障害作用を評価する方法:
 (a)請求項11に記載の腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程;
 (b)前記腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2又はクロモグラニンAの発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の消化管粘膜障害作用を判定する工程であって、ムチン2又はクロモグラニンAの発現低下が認められることが、被検物質が消化管粘膜障害作用を有することの指標となる工程。
[請求項17]
 以下の工程(A)及び(B)を含む、被検物質の消化管粘膜保護作用を評価する方法:
 (A)消化管粘膜障害作用を示す物質の存在下、請求項11に記載の腸管上皮細胞様細胞に被検物質を接触させる工程;
 (B)前記腸管上皮細胞様細胞におけるムチン2又はクロモグラニンAの発現を検出し、検出結果に基づき被検物質の消化管粘膜保護作用を判定する工程であって、前記物質によるムチン2又はクロモグラニンAの発現低下の抑制が認められることが、被検物質が消化管粘膜保護作用を有することの指標となる工程。
[請求項18]
 請求項11に記載の腸管上皮細胞様細胞を含む、細胞製剤。
  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • PUBLIC UNIVERSITY CORPORATION NAGOYA CITY UNIVERSITY
  • Inventor
  • IWAO Takahiro
  • MATSUNAGA Tamihide
  • KONDO Satoshi
  • MIZUNO Shota
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DJ DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JO JP KE KG KH KN KP KR KW KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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