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METHOD FOR INDUCING MYOCARDIAL DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS USING LOW-MOLECULAR COMPOUND

Foreign code F180009642
File No. 4592
Posted date Nov 21, 2018
Country WIPO
International application number 2015JP065643
International publication number WO 2015182765
Date of international filing May 29, 2015
Date of international publication Dec 3, 2015
Priority data
  • P2014-113325 (May 30, 2014) JP
Title METHOD FOR INDUCING MYOCARDIAL DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS USING LOW-MOLECULAR COMPOUND
Abstract The present invention is a method for inducing the myocardial differentiation of pluripotent stem cells wherein the method includes (1) a step for culturing pluripotent stem cells in a medium containing a WNT signal activator and PKC activator, and (2) a step for culturing the cells obtained in step (1) in medium containing a WNT signal inhibitor, Src inhibitor, and EGF receptor inhibitor.
Outline of related art and contending technology BACKGROUND ART
1 Cause of death in the world and at heart disease, heart transplantation in patients with severe heart failure only treatment but, that suffers from shortage of donors. An alternative to heart transplantation as a therapy, such as ES cells or iPS cells derived from pluripotent stem cells and cardiac muscle cell transplantation is a promising, quickly implementation is desired. However, the pluripotent stem cell-derived myocardial cells is for application to regenerative medicine, a major problem that the production cost and safety must be solved.
Is implanted in a human cardiac muscle cells, at least 10 billion (10 9 of the n-th power) of mass cell requirement for the considered. However, the current method to induce the differentiation of pluripotent stem cells of the myocardium is -, growth factor or cytokine, such as serum albumin protein due to the need for a large amount, an extremely high cost. Specifically, 9 of the n-th power of 10 required for producing a cardiomyocyte culture medium only (10 liter), the estimated cost of 1 million yen or more becomes. In fact, part of the current commercially available human pluripotent stem cell derived from cardiac muscle cells are an extremely small capacity and expensive (10 6 to the square of the scale of several hundred thousand yen) and, 10 needed to implant the cells of the n-th power of 9 to several hundreds of million yen and calculation. Therefore, the cost of the myocardial differentiation induction medium is reduced, the heart is extremely important in the realization of regenerative medicine has been a problem.
In addition, in the aspect of safety, the current to induce the differentiation of cytokine or protein in the culture medium becomes a problem. All these proteins can be, an animal cell or a bacterium, yeast or the like and is hence, risk of infection from its original cells (virus, mycoplasma, prions etc.) occurs. Myocardial differentiation induction is particularly, for one step is a step before transplantation, infection risk here should be reduced as much as possible.
Scope of claims (In Japanese)請求の範囲 [請求項1]
 多能性幹細胞の心筋分化誘導法であって、以下の工程を含む方法:
(1)多能性幹細胞をWNTシグナル活性化剤およびPKC活性化剤を含む培地中で培養する工程、および;
(2)工程(1)で得られた細胞をWNTシグナル阻害剤、Src阻害剤、およびEGF受容体阻害剤を含む培地中で培養する工程。

[請求項2]
 Wntシグナル阻害剤が、以下の式(I)の化合物またはその塩である、請求項1に記載の方法:
 式(I):
[化61]

[式中、
 R 1-R 5は、各々独立して、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1~5の直鎖又は分岐アルコキシ基;非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1~5の直鎖又は分岐アルキル基;又は基-NR 12R 13(R 12及びR 13は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1~5の直鎖または分岐アルキル基である)である、ここでR 1-R 5のうち隣接する2つが一緒になって-O-CH 2-O-または-O-(CH 22-O-を形成していてもよい、
 R 6-R 9は、各々独立して、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1~5の直鎖又は分岐アルコキシ基;基-C(O)Aで置換された炭素数1~5の直鎖又は分岐アルコキシ基(Aは、非置換又は炭素数1~5の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和5または6員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される1または2個の原子を含んでいてもよい);非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1~5の直鎖又は分岐アルキル基;又は基-NR 12R 13(R 12及びR 13は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1~5の直鎖または分岐アルキル基である)である、ここでR 6-R 9のうち隣接する2つが一緒になって-O-CH 2-O-または-O-(CH 22-O-を形成していてもよい、
 R 10-R 11は、各々独立して、水素原子;又は炭素数1~5の直鎖又は分岐アルキル基である、
 Xは、-CR 14(R 14は、水素原子、ハロゲン原子、水酸基、炭素数1~5の直鎖又は分岐アルコキシ基、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1~5の直鎖又は分岐アルキル基である);酸素原子;硫黄原子;セレン原子;又は基-NR 15(R 15は、水素原子、炭素数1~5の直鎖又は分岐アルキル基、又は炭素数1~5の直鎖又は分岐アシル基である)である、および
 nは、0から6の整数である]。

[請求項3]
 R 1、R 4、R 5、R 6、R 9、R 10及びR 11が水素原子であり、
 R 2及びR 3が、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、
 R 7が、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1~5の直鎖又は分岐アルコキシ基;基-C(O)Aで置換された炭素数1~5の直鎖又は分岐アルコキシ基(Aは、非置換又は炭素数1~5の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和5または6員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される1または2個の原子を含んでいてもよい);非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1~5の直鎖又は分岐アルキル基;又は基-NR 12R 13(R 12及びR 13は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1~5の直鎖又は分岐アルキル基である)であり、
 R 8が、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1~5の直鎖又は分岐アルコキシ基;又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1~5の直鎖又は分岐アルキル基であり、又は、
 R 7及びR 8が、一緒になって-O-CH 2-O-または-O-(CH 22-O-を形成しており、
 Xが、硫黄原子であり、および
 nが、0から4の整数である、請求項2に記載の方法。

[請求項4]
 R 1、R 4、R 5、R 6、R 8、R 9、R 10及びR 11が水素原子であり、
 R 2及びR 3が、各々独立して、メトキシ基、エトキシ基、又はプロポキシ基であり、
 R 7が、水素原子;ハロゲン原子;水酸基;炭素数1~5の直鎖又は分岐アルコキシ基;基-C(O)Aで置換された炭素数1~5の直鎖又は分岐アルコキシ基(Aは、非置換又は炭素数1~5の直鎖または分岐アルキル基で置換された飽和または不飽和5または6員環であり、該環は窒素原子、酸素原子、及び硫黄原子から独立に選択される1または2個の原子を含んでいてもよい);非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1~5の直鎖又は分岐アルキル基;又は基-NR 12R 13(R 12及びR 13は、各々独立して、水素原子、酸素原子、又は非置換又はハロゲン原子で置換された炭素数1~5の直鎖または分岐アルキル基である)であり、
 Xが、硫黄原子であり、および
 nが、0から4の整数である、請求項2に記載の方法。

[請求項5]
 R 7が、ハロゲン原子である、請求項4に記載の方法。

[請求項6]
 nが、1から4の整数である、請求項3~5のいずれかに記載の方法。

[請求項7]
 Wntシグナル阻害剤が、以下から選択される化合物またはその塩である、請求項1に記載の方法:
 KY02111
[化62]

 KY01041
[化63]

 T61164
[化64]

 KY02114
[化65]

 KY01045
[化66]

 KY01040
[化67]

 KY02109
[化68]

 KY01042
[化69]

 KY01043
[化70]

 KY01046
[化71]

 PB2852
[化72]

 N11474
[化73]

 PB2572
[化74]

 PB2570
[化75]

 KY02104
[化76]

 SO087
[化77]

 SO102
[化78]

 SO096
[化79]

 SO094
[化80]

 SO3031(KY01-I)
[化81]

 SO2031(KY02-I)
[化82]

 SO3042(KY03-I)
[化83]

および、
 SO2077
[化84]



[請求項8]
 Wntシグナル阻害剤が、KY02111、SO3031(KY01-I)、SO2031(KY02-I)、またはSO3042(KY03-I)である、請求項7に記載の方法。

[請求項9]
 Wntシグナル阻害剤が、SO3042(KY03-I)である、請求項8に記載の方法。

[請求項10]
 工程(2)の培地が2種以上のWNTシグナル阻害剤を含み、前記2種以上のWNTシグナル阻害剤の1つが請求項2~9のいずれかに記載の式(I)の化合物またはその塩であり、他のWNTシグナル阻害剤がIWP2、XAV939、およびIWR1から選択される1種以上の化合物である、請求項1~9のいずれかに記載の方法。

[請求項11]
 2種以上のWNTシグナル阻害剤が、請求項2~9のいずれかに記載の式(I)の化合物またはその塩およびXAV939である、請求項10に記載の方法。

[請求項12]
 WNTシグナル活性化剤が、BIOまたはCHIR99021である、請求項1~11のいずれかに記載の方法。

[請求項13]
 WNTシグナル活性化剤が、CHIR99021である、請求項1~12のいずれかに記載の方法。

[請求項14]
 PKC活性化剤が、PMAまたはプロストラチンである、請求項1~13のいずれかに記載の方法。

[請求項15]
 PKC活性化剤が、PMAである、請求項1~14のいずれかに記載の方法。

[請求項16]
 Src阻害剤が、A419259またはSU6656である、請求項1~15のいずれかに記載の方法。

[請求項17]
 Src阻害剤が、A419259である、請求項1~16のいずれかに記載の方法。

[請求項18]
 EGF受容体阻害剤が、AG1478またはゲフィチニブである、請求項1~17のいずれかに記載の方法。

[請求項19]
 EGF受容体阻害剤が、AG1478である、請求項1~18のいずれかに記載の方法。

[請求項20]
 WNTシグナル活性化剤がCHIR99021であり、
 PKC活性化剤がPMAであり、
 WNTシグナル阻害剤が、KY02111、SO3031(KY01-I)、SO2031(KY02-I)、およびSO3042(KY03-I)から選択される化合物並びにXAV939であり、
 Src阻害剤がA419259であり、および
 EGF受容体阻害剤がAG1478である、請求項1~19のいずれかに記載の方法。

[請求項21]
 WNTシグナル阻害剤が、SO3042(KY03-I)およびXAV939である、請求項20に記載の方法。

[請求項22]
 工程(1)および(2)における培地が蛋白質成分およびペプチド成分を含まない、請求項1~21のいずれかに記載の方法。

[請求項23]
 工程(1)および(2)において細胞を浮遊培養により培養する、請求項1~22のいずれかに記載の方法。

[請求項24]
 工程(1)が1~3日間であり、工程(2)が2~13日間である、請求項1~23のいずれかに記載の方法。

[請求項25]
 多能性幹細胞がサルまたはヒト多能性幹細胞である、請求項1~24のいずれかに記載の方法。

[請求項26]
 多能性幹細胞がサルまたはヒトES細胞またはiPS細胞である、請求項25に記載の方法。

[請求項27]
 心筋細胞の製造方法である、請求項1~26のいずれかに記載の方法。

[請求項28]
請求項1~27のいずれかに記載の方法により得られた心筋細胞。

[請求項29]
 WNTシグナル活性化剤、PKC活性化剤、WNTシグナル阻害剤、Src阻害剤、およびEGF受容体阻害剤を含む、心筋分化促進用キット。

[請求項30]
 WNTシグナル活性化剤がCHIR99021であり、
 PKC活性化剤がPMAであり、
 WNTシグナル阻害剤が、
 KY02111
[化85]

 SO3031(KY01-I)
[化86]

 SO2031(KY02-I)
[化87]

および、
 SO3042(KY03-I)
[化88]

 から選択される化合物並びにXAV939であり、
 Src阻害剤がA419259であり、および
 EGF受容体阻害剤がAG1478である、請求項29に記載の心筋分化促進用キット。

[請求項31]
 WNTシグナル阻害剤が、SO3042(KY03-I)およびXAV939である、請求項30に記載の心筋分化促進用キット。

  • Applicant
  • ※All designated countries except for US in the data before July 2012
  • KYOTO UNIVERSITY
  • Inventor
  • NAKATSUJI, Norio
  • MINAMI, Itsunari
IPC(International Patent Classification)
Specified countries National States: AE AG AL AM AO AT AU AZ BA BB BG BH BN BR BW BY BZ CA CH CL CN CO CR CU CZ DE DK DM DO DZ EC EE EG ES FI GB GD GE GH GM GT HN HR HU ID IL IN IR IS JP KE KG KN KP KR KZ LA LC LK LR LS LU LY MA MD ME MG MK MN MW MX MY MZ NA NG NI NO NZ OM PA PE PG PH PL PT QA RO RS RU RW SA SC SD SE SG SK SL SM ST SV SY TH TJ TM TN TR TT TZ UA UG US UZ VC VN ZA ZM ZW
ARIPO: BW GH GM KE LR LS MW MZ NA RW SD SL SZ TZ UG ZM ZW
EAPO: AM AZ BY KG KZ RU TJ TM
EPO: AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR
OAPI: BF BJ CF CG CI CM GA GN GQ GW KM ML MR NE SN ST TD TG
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